Регуляция функционального состояния нейрона сверхмалыми дозами различных биологически активных веществ неспецифический эффект



Скачать 117.89 Kb.
Дата22.04.2016
Размер117.89 Kb.
РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2003, том 43, № 3, с. 315-319

МАТЕРИАЛЫ III МЕЖДУНАРОДНОГО СИМПОЗИУМА

УДК 615.1:612.015.16:57721

РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ НЕЙРОНА

СВЕРХМАЛЫМИ ДОЗАМИ

РАЗЛИЧНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ

© 2003 г. С. Ф. Терехова*, Т. Н. Греченко

Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН, Москва Институт психологии РАН, Москва

В опытах на нейронах моллюска Helix lucorum изучалось действие биологически активных веществ (БАВ) в сверхмалых дозах (10~15-10~27 моль/л). Исследованы нейроны полуинтактного препарата и полностью изолированные клетки. Контролировали показатели электрической активности клетки -уровень мембранного потенциала (МП), состояние электровозбудимой мембраны и пейсмекерного механизма, чувствительность соматической мембраны к микроаппликациям медиатора ацетилхоли-на (АХ). В опытах использовали следующие вещества: синтетические антиоксиданты двух видов, ГАМК, этанол, серотонин, пептид сна ДСИП, противоопухолевый антибиотик рубоксил, ноотропный препарат ГВС-111 (К-фенил-ацетил-Ь-пролил-глицина этиловый эфир), которые однократно вводили в проточную камеру в концентрации 10"1* - 10~27 моль/л в количестве 0.35 мл. Результаты показали, что все перечисленные вещества вызывали ответы, которые заключались в длительном изменении харак­теристик активности нейрона. В контактный период ответы не зависели ни от вида вещества, ни от его концентрации. Проведенные опыты позволяют выдвинуть предположение о существовании малоизу­ченных путей регуляции функционального состояния нейронов и "скрытого" канала приема и передачи информации, весьма существенного для влияния на процессы жизнедеятельности.



Биологически активные вещества, сверхмалые дозы, моллюск, изолированный нейрон, электри­ческая активность, пейсмекер, хемочувствителъность.

"Сверхмалыми дозами (СМД) биологически активных веществ (БАВ) считаются дозы, эф­фективность которых не может быть объяснена с общепринятых позиций и требует разработки новых механизмов" [1, 2]. Ответ на сверхмалые дозы (10~15 моль/л и ниже) - это особый способ взаимодействия любых биологических объектов с биологически активными веществами. Дейст­вие сверхмалых доз показано в опытах на живот­ных in vivo, на изолированных клеточных мемб­ранах in vitro [3-7]. Детальные изменения биоло­гических характеристик электровозбудимых и хемочувствительных мембран при действии сверхмалых доз БАВ можно изучать на нейронах моллюсков [8]. Использование полуинтактного препарата предоставляет возможность анализа действия вещества на системном уровне, а опыты на полностью изолированных нейронах позволя­ют контролировать начало действия вещества на различные показатели электрической активнос­ти клетки - уровень мембранного потенциала (МП), состояние электровозбудимой мембраны и пейсмекерного механизма, чувствительность со-

*Адресат для корреспонденции: 119991 Москва, ул. Косыгина, 4, ИБХФ РАН; тел.: 939-74-09; e-mail: seren@sky.chph.ras.ru.

матической мембраны к нейромедиаторам (в про­веденных опытах к ацетилхолину).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА

Производили регистрацию электрической ак­тивности отдельных нервных клеток на полуин-тактном препарате, препарате изолированной ЦНС или полностью изолированном нейроне на­земного моллюска Helix lucorum [8-10]. Выделен­ные нейроны помещали в экспериментальную камеру с постоянным протоком физиологическо­го раствора. Биологически активные вещества растворяли в физиологическом растворе и дово­дили до нужной концентрации при помощи посте­пенного разведения (от 10~3 моль/л, уменьшая на каждой ступени концентрацию в 100 раз) и одно­временного встряхивания (20 с). Вещество в соот­ветствующей концентрации однократно вводили в проток физиологического раствора в количест­ве 0.35 мл.

В опытах применяли следующие БАВ, хорошо известные своим действием в функциональных концентрациях: синтетические антиоксиданты двух видов - антиоксидант АО1 (6-метил-2-этил-3-ок-сипиридин, хлоргидрат) и АО2 (4-окси-3,5-дитрет-



315

316

ТЕРЕХОВА, ГРЕЧЕНКО










Рис. 1. Влияние концентрации биологически активных веществ (БАВ) на ответы нейронов, а - изменение ответа на действие деполяризационного внутриклеточного тока при нахождении клеток в физиологическом растворе с разны­ми концентрациями у-аминомасляной кислоты (ГАМК), антиоксиданта АО1 (б) (приведен 90% -ный доверительный интервал) и этанола (в).

бутил-а-метилбензиламин, хлоргидрат); нейроме-диаторы - у-аминомасляная кислота (ГАМК) и се-ротонин; противоопухолевый антибиотик Ruboxyl (нитроксильное производное рубомицина); пеп­тиды - ноотропный дипептид ГВС-111 (N-фенил-ацетил-Ь-пролил-глицина этиловый эфир) и эн­догенный нонапептид ДСИП (дельта-сон индуци­рующий пептид); этанол.

Ответы нейронов на действие веществ в сверх­малых дозах - способность генерировать потен­циалы действия (ПД) в ответ на электрическое внутриклеточное раздражение - оценивали по значению максимального эффекта на кинетичес­кой кривой для каждой концентрации, выражен­ному соотношением ПДЭКС (эксперименталь-ное)/ПДконтр (контрольное). На рис. 1, 3 представ­лены средние значения из 3-10 экспериментов для каждой точки.

Зарегистрирована электрическая активность более 500 идентифицированных и неидентифици­рованных нейронов, 400 из которых полностью изолированные.

Результаты показали, что все перечисленные вещества влияют на электрическую активность нейронов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Нелинейная зависимость "доза-эффект". При

изучении дозовых зависимостей биологических эффектов в небольшой области функциональ­ных концентраций часто удается описать процесс с точки зрения единого механизма. Например, в нейрофизиологических экспериментах, показы­вающих зависимость между количеством выделя­ющегося медиатора и ответом хемочувствитель-ных рецепторов.

При переходе к широкой области концентра­ций приходится отказаться от однозначной ин­терпретации. В наших экспериментах в диапазоне концентраций 10~3 моль/л - 10~27 моль/л мы полу-

чили сложные зависимости доза-эффект для ряда веществ (рис. 1). Каждая зависимость демонстри­рует индивидуальную форму ответов нейрона на предъявление определенного вещества. Для ГАМК - полиморфный тип зависимости, для АО1 - колоколообразный, для этанола - зависи­мость, отражающая постоянное увеличение отве­тов с уменьшением концентрации, которую мож­но тоже определить как полиморфную.

Для объяснения таких зависимостей предло­жены различные модели [11]. Полученные ре­зультаты согласуются с представлениями о раз­личном функциональном участии исследуемых БАВ в жизнедеятельности нейрона. Индивиду­альный характер ответов для каждого вещества подтверждается также различным временем до­стижения максимального значения на кинетичес­кой кривой: для АО1 и АО2 - 60 мин, для ГАМК -120 мин, для этанола - 10 мин.

Возможно, каждая зависимость доза-эффект для конкретного вещества отражает последова­тельное включение разных механизмов дейст­вия БАВ на нейрон в соответствующих облас­тях концентраций. Для области концентраций 10~15-10~19 моль/л проявляется общая закономер­ность: величина максимального эффекта увели­чивается с переходом к СМД.

Удивительно, что растворы ГАМК в "концен­трациях" 10~23 и 10~27 моль/л (молекулы ГАМК в растворе отсутствуют) подавляют электричес­кую активность нейрона и приводят в 60% случа­ев к гибели клетки.

Для того чтобы быть уверенным в том, что на­блюдаемые эффекты, развившиеся при исполь­зовании БАВ в СМД, не являются артефактами, имеющими разное происхождение, были выпол­нены следующие эксперименты (рис. 2). Контро­лировали стабильность электрической активнос­ти нейронов при длительной регистрации до вве­дения вещества. Такие контрольные опыты были



РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ том 43 № 3 2003

317

РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ НЕЙРОНА

А
6 в


Рис. 2. Результаты контрольных опытов, показывающих активность нейрона до введения вещества (А) и ответы ней­рона на введение чистого физиологического раствора (Б) (объяснения в тексте).



А - в нормальном физиологическом растворе через: а - 30, 6- 45, в - 60 и г - 120 мин от начала опыта; Б - при введении физиологического раствора: а — исходная активность, б - через 4 и через 45 мин (в) от момента вве­дения раствора. Калибровка: 10 мВ, 1 с.

выполнены на идентифицированных нейронах, электрическая активность которых хорошо изу­чена (например, на нейроне ЛПаЗ). Проверяли влияние введения чистого физиологического рас­твора и возможный артефакт, который может при этом возникать в процессе введения в проток дополнительного объема. В этом случае увеличе­ние скорости протока могло повлиять на положе­ние микроэлектродов и активность нейрона (вво­дили физиологический раствор, равный объему раствора БАВ в эксперименте). В контрольных опытах ответы клетки на тестирующие стимулы продемонстрировали стабильность состояния ней­рона в течение многих часов наблюдений.

Изменение ответов нейрона во времени при действии веществ в сверхмалых дозах. Электри­ческую активность нервных клеток, подвергну­тых действию БАВ в области сверхнизких кон­центраций (10~15 - 10~19 моль/л), регистрировали в течение многих часов на фоне постоянного мемб­ранного потенциала. Получены данные о дли­тельности воздействия БАВ при его однократном применении (рис. 3). Наиболее кратковременны­ми оказались эффекты, вызываемые этанолом (10~17 моль/л)). Для некоторых нейронов обна­ружено, что при быстром достижении макси­мального эффекта (через 10 мин) восстановле­ние до исходного уровня может произойти уже через 20 мин. Для АО1 (1Q-15 моль/л) и ГАМК (10~19 моль/л) не удалось наблюдать восстановле­ние исходного уровня в течение всего времени эксперимента (на рис. 3 представлены ответы нейронов в течение 70 мин). Ответы нейронов до­стигают максимальных значений и остаются в

дальнейшем на высоком уровне. Так как в тече­ние всего эксперимента происходит обновление физиологического раствора, то создается впечат­ление, что этанол отмывается током физиологи­ческого раствора и его эффект связан с внешним влиянием на мембраны нейрона, а АО1 и ГАМК вызывают длительные изменения в динамике от­ветов, которые не устраняются обновляемым фи­зиологическим раствором; эффект этих веществ, вероятно, сопровождается изменениями во всех структурах нейрона. Любая динамика ответов ней­ронов в области СМД означает непрерывное изме­нение функционального состояния клетки.



Неспецифический характер ответов в кон­тактный период взаимодействия нейрона и био­логически активных веществ в сверхмалых дозах.

Рассмотрим действие веществ в СМД в двух времен­ных периодах. Отдаленные изменения (десятки ми­нут) функционального состояния клетки являются индивидуальными характеристиками действия каж­дого вещества в определенной концентрации. В первоначальный период взаимодействия (кон­тактный период) - через 1-3 мин после введения любого вещества - ответная реакция характери­зуется резким увеличением электрической актив­ности нейрона (рис. 3). На рис. 4 представлены нейрограммы ответов нейронов для разных ве­ществ в разных концентрациях, но в одной облас­ти СМД (10~15 - 10~19 моль/л). Нейрограммы прак­тически одинаковы. В контактный период сверх­слабые изменения во внешней среде приводят к неспецифическим ответам в электрической ак­тивности [12]. По-видимому, нейрон переходит в новое функциональное состояние, которое опре-



РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ том 43 № 3 2003

318

ТЕРЕХОВА, ГРЕЧЕНКО










Рис. 3. Изменение реакции нейронов на действие электрического деполяризационного внутриклеточного стимула при их длительном пребывании в физиологическом растворе после однократного введения биологически активных ве­ществ (БАВ). а - после добавления этанола в концентрации 10 моль/л; 6 - ГАМК в концентрации КГ19 моль/л; в - антиоксиданта АО1в концентрации 1СГ15 моль/л.







Рис. 4. Ответы идентифицированного нейрона ЛПаЗ после введения БАВ - антиоксиданта АО1 в концентрации 10 моль/л (А), этанола (Б) в концентрации 10~17 моль/л, ГАМК в концентрации 10~19моль/л (В) и ГВС-111 в кон­центрации 10 моль/л (Г): а - исходные ответы на внутриклеточное электрическое раздражение деполяризационным током, 6 - ответы на стимул прежней интенсивности через 2 мин для (А), через 2.5 мин для (Б), через 1 мин для (В) и через 2 мин для (Г). Калибровка: 10 мВ, 1 с.

деляет возможность дальнейших изменений во времени. При этом неспецифический эффект от­ветов не коррелирует ни с направленностью, ни с величиной максимальных изменений в отдален­ный период - через десятки минут. По нашим рас­четам через 1 мин после введения вещества в про­ток в концентрации 10~15 моль/л с нейроном мо­жет столкнуться одна молекула вещества. Схемы взаимодействия веществ в сверхмалых дозах с би­ообъектами, предложенные в [3,11,13], не позво­ляют объяснить, почему вещества разного строе­ния, взятые в разных концентрациях, вызывают одинаковые ответы нейрона в начальной стадии. Таким образом, результаты наших эксперимен­тов позволяют предположить, что в контактный период взаимодействие нейрона и вещества в СМД вызывает неспецифический ответ клетки.

Чувствительность нейронов к действию ве­ществ в сверхмалых дозах. Исследования, прове-

денные нами на 400 изолированных нейронах, по­казывают, что чувствительность нервных клеток к веществам в сверхмалых дозах зависит от их ис­ходного функционального состояния, которое определяется уровнем мембранного потенциала (МП), порогом генерации потенциалов действия (ПД), активностью пейсмекерного механизма и возбудимостью хемочувствительной мембраны. Для пейсмекера характерна чувствительность к широкому спектру воздействий - от связанных с активностью специфических рецепторов до экзо­генных, не имеющих четкой адресации к опреде­ленным рецепторным образованиям. Эта особен­ность пейсмекеров обеспечивает их участие в от­ветах на действие БАВ в СМД. На основе данных, полученных на изолированных нейронах, мы мо­жем утверждать, что наибольшей чувствительно­стью к действию БАВ обладает эндогенная пейс-мекерная активность. Известно, что механизм



РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ том 43 № 3 2003

РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ НЕЙРОНА

319



пейсмекерной активности зависит от ионов Са++ [10, 14, 15]. В данной работе было показано, что нахождение клетки в бескальциевом растворе приводит к отсутствию эффекта БАВ. Сравнение литературных и наших экспериментальных дан­ных приводит к предположению об особой роли ионов Са++ в механизмах действия БАВ в СМД.

Результаты всех экспериментов на изолирован­ных нейронах не дают ответа на вопрос о природе сигнала, передаваемого из внешней среды раство­ренным веществом в сверхмалых дозах, а также о системе приема такого сигнала на мембране клет­ки. Однако есть доказательства быстрого распрост­ранения сигнальной информации на всю нервную систему улитки. В опытах с применением БАВ в концентрациях 10~15-10~27 моль/л анализировали электрическую активность полуинтактного препа­рата и препарата изолированной нервной системы. Многие нейроны отвечали включением пейсмекер-ного механизма, другие демонстрировали значи­тельное изменение как фоновой активности, так и ответов на периферические тактильные раздраже­ния (результаты не представлены).

Проведенные эксперименты позволяют выдви­нуть предположение о существовании малоизучен­ных путей регуляции функционального состояния нейронов и "скрытого" неспецифического канала приема и передачи информации, весьма существен­ного для влияния на процессы жизнедеятельности.

Работа поддержана грантами РГНФ № 020600011а, № 03-06-00102а; НШ - 89.2003.6.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


  1. Ашмарин И.П., Каразеева Е.П., Лелекова Т.Е. //
    Рос. хим. жур. 1999. № 5. С. 21-27.

  1. Бурлакова Е. Б. // Рос. хим. жур. 1999. № 5. С. 3-11.

  2. Гуревич К. Г. Ц Вести. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия.

2001. Т. 42. № 2. С. 131-134.

  1. Чепурнов С.А., Чепурнова Н.Е., Аббасова К.П.,
    Гончаров О.Б. II Успехи физиол. наук. 2002. Т. 33.
    № 1. С. 29-39.

  2. Эпштейн О.И. // Рос. нац. конгресс "Человек и ле­
    карство": Симп. "Сверхмалые дозы психотропных
    средств", 14 апреля 2000 г. М., 2002. С. 11-21.

  3. Jonas W, Lin Y, Tortella F. // Neuroreport. 2001. V. 12.
    № 2. P. 335-339.

  4. Shen K.F., Grain S.M. // Brain Res. 1997. V.23, № 2.
    P. 176-190.

  5. Бурлакова Е.Б., Греченко Т.Н., Соколов Е.Н., Тере­
    хова С.Ф. II Биофизика. 1986.Т. 31. № 5. С. 921-923.

  6. Терехова С.Ф., Греченко Т.Н. // II Междунар. симп.
    "Механизмы действия сверхмалых доз": Тез. докл.
    М., 1995. С. 107.




  1. Хлудова Л.К., Соколов Е.Н. II Вестн. Моск. ун-та.
    Сер. 14. Психология. 1983. № 2. С. 79-85.

  2. Сазанов Л.А.,Зайцев С.В. Ц Биохимия. 1992. Т. 57.
    №10. С. 1443—1460.

  3. Терехова С.Ф., Греченко Т.Н. // VI Междунар.
    конф. "Биоантиоксидант": Тез. докл. М.: РАН,
    2002.С. 569 -570.

  4. Burlakova E.B., Konradov A.A., Khudyakov J.V. II Non-
    lin. Biol. 1990. V. 1 P. 77-91.

  5. Parri H.R., Crunelli V. // Neuroreport. 2001. V. 12.
    P. 3897 - 3900.

  6. Penartz C.M., de Jeu M.T., Bos N.P. et al. II Nature.

2002. V. 416. № 6878. P. 286-290.

Поступила в редакцию 18.12.2002



Ultra-Low Doses of Different Biologically Active Substances Regulate Neuronal Functional States

Nonspecific Effect S. F. Terekhova, T. N. Grechenko

Emanuel Institute of Biochemical Physics, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia;

e-mail: seren@sky.chph.ras.ru Institute of Psychology, Russian Academy of Sciences, Moscow

The role of biologically active substances in ultra-low doses (10~15—10~27 mol/1) is discussed from the different points of view. The most detailed analysis of neurobiological effects produced by these doses can be studied on the preparate of completely isolated molluscan neurones. In this case the possibility arises to control the first modifications of action at the electrophysiological characteristics of neuronal activity. These changes of elec­trical activity can be regarded as a reaction to biologically active substance. The following characteristics were controlled: the level of membrane resting potential (MP), the electroexcitable membrane and pacemaker mech­anism, chemical sensitivity of somatic membrane loci to neurotransmitter acetylcholine (Ach). Several sub­stances were used in these experiments: two kinds of synthetic antioxidant, GABA, ethanol, serotonine, DSIP (delta-sleep inducing peptide), antibiotic ruboxil, nootrop GVS-111. The isolated neurones were placed into the special chamber. All these substances (0.35 ml) were added single dosing into this chamber with living physi­ological solution in concentration 10~lj-10~27 то!Д. The results demonstrated that all substances had initiated the development of prolonged neurophysiological responses. The intensities of neuronal reactions didn't de­pend in contact period on the concentration and on the type of substance. It is suggested that these data reveal the existence of unknown modes of regulation of neuronal functional states and presence of hidden channel for information transfer and receiving. This different way of regulation is extremely important influence living or­ganisms.



РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ том 43 № 3 2003


База данных защищена авторским правом ©bezogr.ru 2016
обратиться к администрации

    Главная страница