Получение и изучение свойств белка ядерного экспорта вируса гриппа а (nep) Головко Анастасия Олеговна



Скачать 19.39 Kb.
Дата18.11.2016
Размер19.39 Kb.
Получение и изучение свойств белка ядерного экспорта вируса гриппа А (NEP)

Головко Анастасия Олеговна

Студентка

Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, химический факультет

nastiagolovko@mail.ru

Вирус гриппа представляет собой сферическую частицу, оболочка которой формируется белком M1. Транскрипция и репликация генома вируса происходят в ядрах инфицированных клеток, поэтому необходим экспорт собранных новых РНП комплексов из ядра. Эти процессы происходят с участием клеточных белков ядерного экспорта, а также вирусных белков М1 и NEP (белок ядерного экспорта). Структура комплекса NEP и M1 изучена недостаточно. Данные рентгеноструктурного анализа полноразмерных белков отсутствуют.

В структуре белка NEP различают чувствительный к протеазам N-концевой домен, а также высокоструктурированный С-концевой домен, который (по данным рентгеноструктурного анализа) состоит из двух альфа-спиралей С1 и С2, соединенных коротким линкером. В образуемой альфа-спиралями шпильке имеется гидрофильный участок, который, предположительно, вовлечен в образование комплекса с белком M1. В этом участке расположен гидрофобный остаток Trp78, окруженный кластером остатков глутаминовой кислоты. Из данных литературы известно, что замена Trp78 на серин приводит к нарушению взаимодействия NEP с белком M1. В связи с этим представлялось целесообразным провести более детальное исследование функциональную значимости этого остатка путем получения новых мутантных вариантов белка с заменой остатка Trp78 на глицин и тирозин.

Для получения препаративных количеств белка NEP, а также проведения экспериментов по сайт-специфическому мутагенезу, был использован специально сконструированный экспрессионный вектор с геном белка NEP, содержащим на 3’-конце модуль, кодирующий последовательность His(6) для аффинного выделения белка. Введение целевых мутаций в ген осуществляли методом ПЦР. Белок природной структуры, а также его мутантные варианты экспрессировали в клетках E.coli ER1821. После лизиса клеток и отделения клеточного дебриса белки выделяли из супернатанта методом аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе. Часть белка оказывалась в тельцах включения, из которых после солюбилизации было выделено дополнительное количество белка. Производительность полученного штамма-продуцента – около 2-х мг рекомбинантного белка NEP в 100 мл культуры.



  1. Crimmins D.L., Sheenah M.M. Current Protocols in Protein Science. Chemical Cleavage of Proteins in Solution. 2005.

  2. Hatice A., Kiyoko I., Takeshi N. Structure-based design of NS2 mutants for attenuated influenza A virus vaccines // Virus Res. 2011. p. 240–248.

  3. Greenspan D., Krystal M. Expression of Influenza Virus NS2 Nonstructural Protein in Bacteria and Localization of NS2 in Infected Eucaryotic Cells // Journal of virology. 1985. Vol. 54, №3. p. 833-843.

  4. Paterson D., Fodor E. Emerging Roles for the Influenza A Virus Nuclear Export Protein (NEP) // PLOS Pathogens. 2012, №8 (12). p. 1-8.


База данных защищена авторским правом ©bezogr.ru 2016
обратиться к администрации

    Главная страница