Методические указания мук 3 721-98 3 Пищевые продукты и пищевые добавки. Определение безопасности и эффективности биологически активных добавок к пище"



страница5/8
Дата22.04.2016
Размер1.29 Mb.
1   2   3   4   5   6   7   8

Методы исследования аллергических свойств

биологически активных добавок к пище
1. Оценка влияния БАД на общую анафилактическую реакцию.

Морских свинок 200 - 250 г сенсибилизируют подкожно каким-либо чужеродным белком. Наиболее удобно использовать нормальную лошадиную сыворотку или бычий сывороточный альбумин в дозе 0,1 мл и 10 мг соответственно. Одновременно свинкам вводят "per os" или внутримышечно исследуемую субстанцию - это опытная группа животных. Контролем служит группа свинок, не получавшая БАД. На 14 - 21 день после иммунизации свинкам двух групп внутрисердечно или внутривенно вводят ту же или удвоенную дозу антигена, использованного для сенсибилизации. Реакция у животных наступает через 1 - 2 мин. Наблюдают за животными в течение 30 мин.

Оценка реакции производится по четырехплюсовой системе:

А (+) - кратковременное почесывание носа, взъерошивание шерсти, падение температуры (не менее чем на 1 °);

Б (++) - четко выраженные частые почесывания, единичные чихания, падение температуры;

В (+++) - спастический кашель, боковое положение животного, отделение кала и мочи;

Г (++++) - спазм дыхательных путей, конвульсивные движения, судороги. Животные погибают;

Д - реакция отсутствует.

Полученные результаты в контрольной группе сравнивают с результатами в опытной группе.

В качестве положительного контроля используют животных, сенсибилизированных нормальной гетерологической сывороткой и получивших разрешающую дозу в те же сроки. Одновременно разрешающую дозу испытуемой БАД "per os" вводят животным, которые предварительно получили соответствующий объем 0,9%-ного хлорида натрия - отрицательный контроль.

Индекс синдрома в группе вычисляют по формуле Вейгла (И):
(Ах1) + (Бх2) + (Вх3) + (Гх4)

И = ———————————————————————————————, где

А + Б + В + Г + Д
А, Б, В, Г, Д - число животных с данной выраженностью синдрома.

Изучаемые БАД не должны вызывать развития смертельного шока.



Изучение действия БАД на показатели

окислительно-антиокислительной системы
Общие положения
К основным внутриклеточным химическим повреждающим агентам следует, в первую очередь, отнести свободные радикалы, образование которых приводит к нарушению функционирования клеточных структур, включая биологические мембраны. Наибольшее значение для патологии имеют свободные радикалы кислорода, а также пероксид водорода. Все эти так называемые активные формы кислорода образуются в большом количестве клетками-фагоцитами, а также могут образовываться в митохондриях и эндоплазматической сети других клеток в условиях патологии. Реагируя с ненасыщенными жирными кислотами, входящими в состав мембранных липидов, радикалы инициируют цепную реакцию их перекисного окисления. Реакции перекисного окисления липидов (ПОЛ) тормозятся антиоксидантными системами клетки, благодаря наличию которых скорость реакции образования гидроксильных радикалов и разветвления цепи окисления липидов находится в пределах физиологической нормы. Постоянное образование прооксидантов уравновешено той же скоростью их дезактивации антиоксидантами. Резкое усилие окислительных процессов при недостаточности системы антиоксидантной защиты приводит к развитию "оксидантного стресса", который рассматривается как один из общих механизмов повреждения тканей организма. Реакции окислительного стресса являются результатом нарушения взаимоотношений между оксидантной и антиоксидантной составляющими свободнорадикальных процессов за счет гиперактивности или недостаточности одного из указанных компонентов. В ходе реализации окислительного стресса, являющегося реакцией организменного уровня, создаются условия для развития специфических для нервной системы патологических процессов, что в свою очередь усугубляет окислительный стресс в центральной нервной системе (151).

В связи с вышеизложенным, БАД к пище следует изучать как по изменению активности ферментных систем генерирования свободных радикалов кислорода и гидроперекисей, так и по изменению содержания антиоксидантных белков и ферментов, обеспечивающих утилизацию активных форм кислорода, Н2О2 и липопероксидов.


Методы оценки действия БАД к пище на показатели

перекисного окисления липидов
Мышам-самцам линии линии Balb/c вводят 0,25 мл 7%-ного масляного раствора СС14 - одного из сильнейших стимуляторов ПОЛ, внутримышечно или алиментарно, через 15 - 20 мин животным "per os" вводят исследуемую БАД к пище (5 животных в группе), 5-ти мышам контрольной группы вводят аналогичный объем физиологического раствора. Через 2 сут животных забивают, выделяют печень и определяют продукты перекисного окисления липидов, такие как диеновые коньюгаты (появляются на начальных этапах перекисного окисления), гидроперекиси липидов (обнаруживаются на более поздних этапах перекисного окисления) и малоновый диальдегид (один из наиболее важных конечных продуктов перекисного окисления липидов).

а. Определение малонового диальдегида в гомогенате печени мыши.

Печень мыши растирают в гомогенезаторе Поттера в 3 мл 0,025 М трис-HCl (рН 7,4), содержащей 0,175 ММ хлорида калия. Гомогенат по 2,5 мл помещают в центрифужные пробирки и осаждают белок добавлением 1 мл 17%-ного раствора ТХУ (конечная концентрация 5%). Образующийся осадок отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 4000 g. Надосадочную жидкость переносят в пробирки, добавляют по 1 мл 0,8%-ного водного раствора 2-тиобарбитуровой кислоты и помещают пробы на 10 мин в кипящую водяную баню. В качестве контроля используют пробы, содержащие вместо надосадочной жидкости буфер (рН 7,4). После развития розовой окраски пробы охлаждают до комнатной температуры и измеряют оптическую плотность при 532 нм. Количество малонового диальдегида рассчитывают, используя молярный коэффициент экстикции 1,56*10(5) см(-1)*М(-1), а полученный результат выражают в нмолях на пробу (152).

б. Определение диеновой конъюгации полиненасыщенных высших жирных кислот в гомогенате печени мыши.

Печень мыши растирают в гомогенизаторе Поттера с 9 мл экстрагирующей смеси гептана с изопропиловым спиртом в объемном отношении 1:1. Полученную суспензию центрифугируют 10 мин при 4000 g. Надосадочную фракцию переносят в пробирки и добавляют одну десятую часть объема дистиллированной воды. После 2-кратного встряхивания и расслаивания фаз отсасывают гитпановую фазу. К равным объемам по 0,5 мл добавляют этиловый спирт в отношении 1:5 - 1:10. Оптическую плотность проб измеряют при 233 нм. В качестве контроля используют только экстрагирующую смесь.

Содержание диеновых конъюгатов рассчитывают, исходя из величины молярного коэффициента экстинкции при 233 нм для сопряженных диенов ПНЖК, равного 2,2*10(5) см(-1)*М(-1) (152).

в. Определение гидроперекиси липидов в гомогенате печени мыши.

Печень мыши растирают в гомогенизаторе Поттера в 3 мл 0,025 М трис HCL буфера (рН 7,4), содержащей 0,175 М хлорида калия. Гомогенат по 2,0 мл помещают в центрифужные пробирки и осаждают белок добавлением 0,2 мл 50%-ного раствора ТХУ (конечная концентрация 5%). Образующийся осадок отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 4000 g. 2 мл надосадочной жидкости доводят 96%-ным этанолом до 27 мл. К равным объемам до 27 мл добавляют 0,2 мл концентрированной соляной кислоты и 0,025 мл 5%-ного раствора соли Мора в 3%-ной соляной кислоте, пробы интенсивно встряхивают. Точно через 30 с приливают 1 мл 20%-ного раствора тиоцианата аммония, после чего развивается малиновая окраска. В качестве контроля используют пробы, содержащие 96%-ный этанол вместо НЖ. Изменение оптической плотности проводят в течение 10 мин после добавления тиоцианата аммония при 480 нм. Об относительном уровне гидроперекисей в биологическом материале судят по величине оптической плотности при 480 нм (152).


12.3. Экспериментальная схема модели на лабораторных

животных для оценки эффективности профилактического

действия парафармацевтиков
———————————————————————————————————————————————————————————————————————

|Вид животных |Количество |Количество |Продолжительность|Название |

| |групп |животных |опыта |групп |

| |животных |в группе | | |

|—————————————————|———————————|————————————|—————————————————|——————————|

|крысы, мыши, | 3 | 8 - 10 |в зависимости от |контроль |

|кролики и др. | | |срока получения |опыт-1 |

| | | |модели |опыт-2 |

———————————————————————————————————————————————————————————————————————

Описание экспериментальных групп:

контроль - животные находятся на общевиварном рационе или на обычном полусинтетическом рационе;

опыт-1 - крысы вместе с рационом получают изучаемую БАД к пище на протяжении одного месяца;

опыт-2 - крысы на протяжении первого месяца находятся на общевиварном или обычном полусинтетическом рационе.

Через месяц от начала опыта у крыс групп опыт-1 и опыт-2 получают модель патологического состояния или помещают их в экстремальные условия.

Далее, используя соответствующие тесты, оценивают профилактические свойства изучаемой БАД.

Конкретные модели патологических и экстремальных состояний изложены в приложениях к разделу "Парафармацевтики".


13. О порядке проведения клинических испытаний

биологически активных добавок к пище
1. При направлении Федеральным центром госсанэпиднадзора в экспертный совет Института питания РАМН материалов для проведения гигиенической экспертизы и выдачи заключения с целью последующей Государственной регистрации какого-либо типа БАД вопрос о необходимости проведения клинических испытаний этой БАД решается главным экспертом экспертного совета.

2. Клинические испытания биологически активных добавок к пище осуществляются, как правило, в контролируемых условиях стационара или в амбулаторных условиях в специализированных учреждениях, которые располагают квалифицированными специалистами в области науки о питании или в соответствующей области медицины, современным научным оборудованием, хорошей многопрофильной клинической базой и аккредитованных на проведение подобных исследований в порядке, установленном МЗ РФ.

3. Образцы биологически активных добавок к пище предоставляются фирмой в том количестве, которое предусматривается программой испытания.

4. Схема проведения испытаний биологически активных добавок к пище включает следующие этапы:

- экспериментальную и/или аналитическую оценку основных компонентов БАД к пище на основании представленной фирмой-производителем документации и результатов исследований (см. разделы 4, 5, 6);

- разработку программ клинических испытаний биологически активных добавок к пище, которая определяется, с одной стороны, особенностями химического состава и предполагаемого биологического действия исследуемых БАД на организм, применительно к тем нозологическим формам заболевания, при которых использование добавок с профилактической целью представляется наиболее адекватным и перспективным, а с другой стороны, типом функциональных и метаболических нарушений, свойственных данной патологии;

- определение методики проведения клинических испытаний. Для получения достоверных данных о профилактическом действии БАД к пище необходимым условием является наличие двух групп: основной (опытной) и контрольной. Они могут формироваться из здоровых лиц или больных с определенной патологией. Группы сравнения должны быть максимально сходными по половозрастному признаку, массе тела, пищевому статусу. В случае проведения испытаний на больных, помимо этого учитывается степень тяжести основного заболевания, характер сопутствующей патологии. Оценка эффективности БАД к пище осуществляется на фоне идентичных режимов питания в опытной и контрольной группах. Предпочтительным при этом является использование двойного слепого метода испытаний с применением плацебо в контрольной группе. В процессе проведения клинических испытаний определяются органолептические свойства БАД и их переносимость, осуществляется оценка их эффективности, выявление возможных побочных эффектов;

- помимо общих клинических показателей в план исследований включаются гематологические и специальные функциональные тесты, биохимические, микробиологические, иммунологические и другие показатели. Выбор критериев оценки эффективности апробируемых БАД к пище определяется характером испытуемых БАД и клинико-патогенетическими особенностями нозологических форм, при которых они применяются;

- продолжительность клинической апробации устанавливается в зависимости от типа БАД к пище и по согласованию с фирмой-заявителем;

- в заключении по итогам испытания БАД должны быть представлены результаты изучения переносимости БАД, ее эффективности, рекомендуемая дозировка БАД, показания к применению, возможные побочные эффекты.


Клиническая оценка эффективности БАД к пище

и их переносимости
1. Оценка органолептических свойств БАД и их переносимости
Изучение органолептических свойств БАД осуществляется с использованием анкетно-опросного метода. Оценивается вкус, запах, цвет, консистенция БАД, наличие посторонних запахов и т. д.

Переносимость БАД оценивается путем клинического наблюдения по субъективным и объективным признакам. Исследуется:

- состояние кожных покровов;

- системы пищеварения;

- сердечно-сосудистой системы и других органов и систем организма.
2. Оценка БАД по общеклиническим показателям:
- определение росто-весовых параметров (с использованием индекса Кетле);

- определение других антропометрических показателей (измерение окружности плеча, талии, бедер);

- определение тощей и жировой массы тела (по показаниям);

- оценка влияния БАД на общее состояние наблюдаемого контингента и состояние различных органов и систем организма;

- общий анализ мочи и крови;

- определение биохимических показателей - содержание в сыворотке крови общего белка, холестерина, билирубина, глюкозы, активности аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы, креатинина, азота мочевины.

Все исследования осуществляются в динамике, как минимум 2 раза, до применения БАД и после завершения курса лечения.
3. Перечень дополнительных специальных тестов,

используемых при клинических испытаниях

различных типов БАД
3.1. Биологически активные добавки к пище - источники белка и аминокислот.
———————————————————————————————————————————————————————————————————————

| Показатель |Литературный |

| |источник |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Содержание в сыворотке крови: | |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Общий белок | (24) |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Белковые фракции (альбумины глобулины) | (26 - 27) |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Креатинин | (100) |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Азот мочевины | (101) |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Мочевая кислота | (102) |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Отдельные аминокислоты (по показаниям) | (133) |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Содержание в моче (по показаниям) | |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Креатинин | (100) |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Азот мочевины | (101) |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Отдельные аминокислоты | (23) |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Балансовые исследования обмена белка (по показаниям) | (24) |

———————————————————————————————————————————————————————————————————————


3.2. Биологически активные добавки к пище - источники липидов.

Биохимические показатели
———————————————————————————————————————————————————————————————————————

| Показатель |Литературный |

| |источник |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Содержание в сыворотке крови | |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Общий холестерин | (103) |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Триглицериды | (104) |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Липопротеиды высокой плотности (по показаниям) | (107, 108) |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Липопротеиды низкой и очень низкой плотности (по | (107, 108) |

|показаниям) | |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Продукты перекисного окисления липидов (по показаниям)| (110) |

|малоновый диальдегид, диеновые коньюгаты | |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Аполипопротеины А1, В (по показаниям) | (133) |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Показатели антиоксидантной защиты организма (по пока- |(36, 35, 42, |

|заниям): ферменты (каталаза, супероксиддисмутаза, |109, 111, 133) |

|глутатионпероксидаза, глютатионреуктаза) витамин А, | |

|витамин Е, витамин С, SH-группы, селен | |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Эссенциальные жирные кислоты (по показаниям) | (28) |

|Жирно-кислотный состав тромбоцитов и эритроцитов | (31) |

|(по показаниям) | |

|Содержание и состав фосфолипидов в тканях (по показа- | (32) |

|ниям) | |

———————————————————————————————————————————————————————————————————————
3.3. Биологически активные добавки к пище - источники углеводов.
———————————————————————————————————————————————————————————————————————

| Показатель |Литературный |

| |источник |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Содержание в сыворотке крови | |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Гликемия натощак | (57, 58) |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Гликемический профиль | (57, 58) |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Гликемические кривые с нагрузкой (по показаниям) | (57, 58) |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Триглицериды (по показаниям) | (104) |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Гликозилированный гемоглобин (по показаниям) | (105) |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Содержание в моче | |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Содержание глюкозы в суточном количестве мочи | (56, 57) |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Реакция на ацетон (по показаниям) | (119) |

———————————————————————————————————————————————————————————————————————


3.4. Биологически активные добавки к пище, содержащие пищевые волокна (ПВ).
При оценке БАД, содержащих пищевые волокна, используются:

- изучение характера стула;

- капрологическое исследование;

- инструментально-графические тесты, характеризующие моторно-эвакуаторную функцию желудочно-кишечного тракта (по показаниям) (128);

- микробиологический анализ для характеристики изменений в кишечной микрофлоре под влиянием БАД (по показаниям) (125);

- дуоденальное зондирование с определением химического состава желчи (по показаниям): концентрация холестерина, холевой кислоты, дезоксихолевой кислоты, фосфолипидов (124);

- микробиологический анализ желчи (по показаниям);

- изучение аноректического эффекта БАД;

- биохимические показатели:

———————————————————————————————————————————————————————————————————————

| Показатели |Литературный |

| |источник |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Содержание в сыворотке крови | |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Холестерин | (103) |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Билирубин | (97) |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Щелочная фосфатаза | (98) |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Глюкоза (по показаниям) | (57, 58) |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Витамины группы В, С (по показаниям) | (35, 38, 39) |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Фолиевая кислота (по показаниям) | (35) |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Минеральные вещества (по показаниям) | (35, 41) |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Липиды в кале (по показаниям) | (120) |

———————————————————————————————————————————————————————————————————————
3.5. Биологически активные добавки к пище - источники витаминов.
При изучении эффективности БАД, основными компонентами которых являются витамины, критерием оценки служит динамика изменения витаминной обеспеченности организма под влиянием этих БАД к пище по содержанию витаминов в сыворотке крови и выделению их с мочой.
3.6. Биологически активные добавки к пище - источники минеральных веществ.
Эффективность этой категории БАД к пище подтверждается путем изучения динамики изменения концентрации соответствующих микро- и макроэлементов в биологическом материале, а также тех биологических эффектов, которые реализуются в организме в процессе накопления вводимых в БАД нутриентов.

Так, эффективность содержащих железо БАД определяется по показателям гемоглобинового и транспортного фонда железа:

———————————————————————————————————————————————————————————————————————

| Показатели в периферической крови |Литературный |

| |источник |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Гемоглобин | (106) |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Количество эритроцитов | (106) |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Цветной показатель | (106) |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Концентрация железа в сыворотке крови | (41, 121) |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Коэффициент насыщения трансферрина (по показаниям) | (106) |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Трансферрин (по показаниям) | (43) |

|——————————————————————————————————————————————————————|————————————————|

|Церулоплазмин (по показаниям) | (43) |

———————————————————————————————————————————————————————————————————————

1   2   3   4   5   6   7   8


База данных защищена авторским правом ©bezogr.ru 2016
обратиться к администрации

    Главная страница