Исследование происхождения gar-домена белков эукариот Работу выполняют: Владимиров С. А. Зонов М. Н. Под руководством



Скачать 108.57 Kb.
Дата15.11.2016
Размер108.57 Kb.
Специализированный учебно-научный центр им. А.Н. Колмогорова

Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Литературный обзор к курсовой работе по теме
Исследование происхождения GAR-домена белков эукариот

Работу выполняют:

Владимиров С.А.

Зонов М.Н.


Под руководством

Свистуновой Д.М.

Москва 2013

Введение и цели работы

Жизнь зародилась на нашей планете много лет назад, и развивается в соответствии со своими законами до сих пор. Эволюционное развитие может отражаться в изменении анатомических или физиологических свойств организма или, в случае многоклеточных, его отдельных клеток. Но на основании подобных данных сложно что-то предположить о происхождении эукариотических организмов – процессе, произошедшем 1.2 миллиарда лет назад. Существуют процессы, которые происходят во всех без исключения клеточных организмах на Земле и являются основой жизни, какой мы её себе представляем. Транскрипция (синтез РНК), трансляция (синтез белков), гликолиз (анаэробный энергетический обмен) и связанные с ними процессы являются основой клеточной жизни и любое изменение в них говорит о фундаментальном изменении биохимии организма. Чтобы изучать происхождение жизни в том виде, в котором она есть сейчас, необходимо обратиться к изучению молекулярной эволюции, то есть изменений в аминокислотных последовательностях белков и роли этих изменений в жизнедеятельности организмов. Изучение эволюции белков позволяет получать знания о том, как развивалась жизнь, строить теории насчёт происхождения тех или иных видов или более широких таксономических единиц, в том числе домена эукариот. Цель данного исследования – изучить эволюцию GAR-домена белков эукариот и выяснить, как изменялось его функциональное назначение в процессе формирования эукариотической жизни на ранних этапах.



Обзор литературы

Ядро эукариотической клетки – упорядоченная структура, в которой происходят различные фундаментальные биохимические процессы, такие как транскрипция (считывание ДНК), синтез рибосом и манипулирование составом хроматина – комплекса из ДНК и различных белков, выполняющих всевозможные функции. Ядро содержит различные структуры, в числе которых ядрышки – самые крупные структуры, легко различимые в световой микроскоп из-за своей высокой плотности. Одной из основных функций ядрышка является образование рибосом – комплексов, состоящих из рибосомальной РНК (рРНК) и белков, и осуществляющих трансляцию – синтез белков на матрице информационной РНК. В ядрышках c ДНК считывается так называемая пре-рРНК, являющаяся предшественником молекул зрелой рРНК. Ещё в процессе транскрипции пре-рРНК связывается с белками рибосом, образуя в конечном итоге рибонуклеопротеид, который после окончания транскрипции подвергается процессингу – из 45S рРНК вырезаются ненужные участки, и молекула распадается на несколько более коротких: 28S, 18S и 5.8S. Тогда же к ним присоединяется 5S рРНК, которая считывается с другого гена вне ядрышка. Затем из рРНК и связанных с ними белков собираются и зреют малая и большая субъединицы рибосом, которые потом экспортируются из ядра в цитоплазму, где они и выполняют свою основную функцию. Для нормального функционирования ядрышка необходимо, чтобы все его компоненты было собраны в одной области ядра рядом с генами рРНК, а не были рассеяны по всему объему клетки. За локализацию белка в ядрышке отвечает особая аминокислотная последовательность в его составе, называемая сигналом ядрышковой локализации. Сигналы ядрышковой локализации бывают различными и могут выполнять какие-то побочные функции. Чаще всего сигналы ядрышковой локализации представлены положительно заряженными участками на конце белка.

Домены белков – это, в большинстве своем, длинные последовательности аминокислот, имеющие определённую вторичную или третичную структуру, в то время как мотивы – короткие и неструктурированные участки белков с характерной последовательностью аминокислот, которые часто входят в состав доменов, повторяясь некоторое количество раз. Домены, которые содержит белок, обеспечивают присущие ему свойства и таким образом влияют на работу белка. Домены белков могут проявлять ферментативную активность, как, к примеру, домены протеинкиназы или метилтрансферазы. Домены могут иметь свойство связываться с определёнными нуклеотидными или белковыми последовательностями, как SH3-домен или FaB-домен антител. Домены белков способны правильно функционировать только при взаимодействии с определёнными доменами других белков или с короткими консервативными мотивами своих лигандов – других белков или же нуклеиновых кислот, у которых также могут быть выделены мотивы в нуклеотидной последоиовательности. Аминокислотная последовательность мотива или домена белка определяет его функции и особенности.

Глицин (G) – полярная незаряженная аминокислота, простейшая из всех существующих (NH2-CH2-COOH) и не имеет оптических изомеров. Аргинин (R) – это положительно заряженная аминокислота, которую можно часто обнаружить в различных мотивах белка. В нашей работе мы сосредоточимся на RG/RGG-мотиве, который представляет собой повторы последовательностей RGG и RG. Было установлено, что среди аргининов на C-конце ядрышкового белка нуклеолина (RGGGFGGGRGGFGDRGGRGGGRGG) есть диметилированные, в связи с чем можно предположить, что RGG-последовательности – сайт распознавания субстрата для белковых аргининовых метилтрансфераз (PRMT). Сейчас хорошо известно, что аргинины в GRG и RGG последовательностях – предпочитаемые

с
Расположение RG/RGG мотива в различных белках эукариот.
айты для некоторых PRMT. Такие домены, содержащие метилированный аргинин в RG/RGG мотивах, часто называют glycine-arginine-rich (GAR) доменами. Из-за большого количества аргинина GAR-домен заряжен положительно, а также не имеет консервативной вторичной и третичной структуры. GAR-домен найден во многих белках эукариот, отвечающих за процессинг пре-рРНК, в частности это нуклеолин, фибрилларин и белки малого ядрышкового рибонуклеопротеида (hnRNP). GAR-домен в большинстве случаев находится на конце белка, причём может находиться как на С-конце, так и на N-конце. Предполагается, что это связано с отсутствием у него определенной вторичной структуры. В редких случаях GAR-домен находится в середине белка – в данном случае его особенности неизвестны. Установлено, что GAR-домен на конце белка является сигналом ядрышковой локализации, причём чем в нём меньше положительно заряженных аргининовых остатков, тем менее выражена эта функция – с уменьшением размера и заряда GAR-домена белок сначала делокализуется по всему ядру, а затем . С помощью выравнивания гомологичных белков эукариот было показано, что несмотря на высокую консервативность функционального домена белка, последовательность его GAR-домена может широко варьироваться даже в относительно близких группах организмов.

О


Выравнивание фибрилларина разных организмов. Несмотря на общую консервативность, можно заметить, что GAR-домен полностью отсутствует у фибрилларина бактерий.
днако, помимо эукариотических организмов существуют также и прокариотические – бактерии и археи. Биохимические процессы прокариот, оставаясь теми же, что и у эукариот, тем не менее во многом отличается как биохимически, так и физиологически. В частности, у прокариот отсутствует ядро, несмотря на что рибосомы в клетках прокариот присутствуют, и процессинг пре-рРНК, необходимый для их образования, происходит образом, схожим с таковым у эукариот. Различаются размеры как рРНК, так и рибосомальных субъединиц, но в целом процесс один и тот же. Белки процессинга, как фундаментального биохимического процесса, весьма консервативны, однако сигналы ядрышковой локализации в них отсутствуют, в том числе и GAR-домен. Так как белки эти плохо подлежат изменению в процессе эволюции, постепенное появление около 80 аминокислот на одном из концов можно поставить под сомнение.

РНК-хеликазы – белки, осуществляющие процесс расплетения двухцепочечной РНК и превращения её в одноцепочечную. Семейство АТФ-зависимых РНК-хеликаз DeaD-box х


Карта консервативных мотивов DeaD-box РНК-хеликазы подсемейства DDX4/VASA. Число – номер аминокислоты в последовательности.
арактеризуется наличием нескольких консервативных мотивов. У бактерий DeaD-box хеликазы выделены в отдельный класс, в то время как у эукариот он разделён на различные подсемейства со схожей консервативной частью, но различающимися концевыми доменами. DeaD-box хеликазы бактерий способны расплетать как большие участки двуцепочечной РНК, так и в нутримолекулярные шпильки, и участвуют в процессах деградации мРНК и процессинга пре-рРНК во время формирования рибосомы. Функции этих белков у прокариот дополнились также инициацией т
Варианты механизмов процессинга пре-р-РНК прокариот и роль РНК-хеликаз DeaD
рансляции, ингибированием терминации транскрипции, ядерным экспортом, аффинным связыванием РНК. При этом хеликазы тем не менее остались более-менее специализированы в своих функциях за счёт увеличения количества белков и их дифференциации. Так, например, в белках класса DDX3/DED1 животных обнаружено сходство в действии с белком elF4AIII, действующем в составе комплекса связывания экзонов EJC в качестве зажима для РНК (RNA clamp). Белок может не расщеплять АТФ для расплетения РНК, а оставаться прочно связанным с РНК и служить местом прикрепления других белков, в результате образующих комплекс.


Функционирование EJC. Можно заметить, что сам по себе процесс расплетения РНК не нужен для функционирования комплекса, а отвечает лишь за прочное неспецифическое связывание.

Механизм работы EJC. elF4AIII – белок с хеликазной активностью,а Y14 отвечает за распознавание РНК, причём механизм неизвестен.



Задачи исследования
Работа проводилась с помощью анализа базы данных белковых последовательностей UniProt. В задачи данного исследования входило:

  1. Найти белки прокариот, содержащие GAR-домен.

  2. Найти эукариотические белки, содержащие GAR-домен, являющиеся потомками известных прокариотических белков, содержащих GAR-домен.

  3. Установить изменения, произошедшие с функциями этих белков в процессе эволюции и сопоставить их с изменениями в консервативной части белка.

  4. Установить изменения, произошедшие с GAR-доменом.

Стоит дополнить, что под «потомком» того или иного белка подразумевается не обязательно белок с той же консервативной частью. В течение такого длительного процесса, как появление и раннее развитие эукариот, не исключены различные взаимодействия генов, при которых разные белки могут обмениваться доменами. Так, если в бактериальном геноме гены, кодирующие белки, находятся рядом в пределах одного оперона, то при нескольких случайных нуклеотидных заменах, повлекших за собой изменение положения старт- или стоп-кодона, может произойти перемещение большого количества аминокислот из одного белка в другой. При этом, если белки работают в составе одного комплекса, перемещение функционального домена может не иметь летальных для клетки последствий, но внести существенный вклад в дальнейшую эволюцию.

Результаты
При анализе базы данных для исследования были выбраны белки семейства РНК-хеликаз DEAD box как удовлетворяющие нашим условиям: у бактериальных хеликаз присутствует C-концевой GAR-домен длиной в 50-80 аминокислот и консервативные мотивы, описанные в литературе. В белках эукариот замечена дифференциация расположения GAR-домена. У белков семейства DDX4/VASA (есть только у животных) наблюдается GAR-домен на N-конце, у семейства DDX21/DDX50 (у животных и у растений) – GAR-домен длиной 30-50 аминокислот на N-конце. У класса DDX3/DED1 наблюдается разделение в зависимости от царства эукариот, к которым принадлежит белок. У растений в таких белках GAR-домен отсутствует в принципе, а на обоих концах белка находится глицин-богатый домен (далее – G-домен); у животных и грибов даже в пределах одного организма встречаются различные белки, где на C-конце всегда присутствует GAR-домен или G-домен, а на N-конце один из этих доменов может присутствовать, а может и не присутствовать. Таким образом, GAR- и G-домен присутствуют на обоих концах белка в любых комбинациях, но, так или иначе, в большинстве не-растительных хеликаз DDX3/DED1 GAR-домен присутствует.

Если в бактериальных белках GAR-домен находится непосредственно на С-конце, то для белков эукариот это не всегда справедливо. Когда, говоря о эукариотах, мы утверждаем, что GAR-домен находится на C-конце, имеется в виду, что от конца белка его могут отделять 20-30 аминокислот, практически не несущих заряда и не составляющих собой какой-либо консервативный мотив. В случае N-конца промежуток почти всегда есть и составляет как правило 30-50 аминокислот.

Различие в положении GAR-домена среди класса сравнительно консервативных белков в совокупности с тем фактом, что внутри подсемейства оно достаточно консервативно (особенно у растений) свидетельствует о том, что увеличение числа DeaD-box РНК хеликаз должно было происходить на ранних стадиях развития эукариотической жизни, когда геном ещё небольшой и обмен большими участками между генами является возможным, а также ещё не нарушены механизмы межорганизменной передачи наследственной информации. Тем не менее, чёткие границы между белками разных царств эукариот говорят о том, что изменения произошли уже после разделения LUCA растений, животных и грибов.

Из сопоставления литературных данных и результатов исследования базы данных можно сделать выводы о функциях GAR-домена. Для классов DDX21/DDX50 описаны функции, требующие локализации в ядре и в ядрышке, что не противоречит экспериментальным данным из других источников, характеризующим GAR-домен как сигнал ядрышковой локализации. Однако у класса DDX3/DED1 помимо общих функций описаны дополнительные, варьирующиеся в зависимости от организма, белок которого исследуется. Для белков этого класса, взятых из животных, была описана способность прочно и неспецифично связываться с РНК и выполнять функцию каркаса, на которые крепятся другие белки. Это было сделано исходя из аналогии с белком elF4AIII в составе комплекса EJC, который тоже имеет хеликазную активность. В белках растений прочного связывания добиться не удалось. Так как отличия между DDX3/DED1 хеликазами животных и растений состоят в наличии GAR-домена, можно предположить, что именно он отвечает за прочное связывание с РНК, что обусловлено в том числе и электростатически. Более того, в Y14 - белке комплекса EJC, отвечающем за распознавание РНК, был также обнаружен концевой GAR-домен.



Выводы

Анализируя результаты проделанной работы можно прийти к следующим выводам:



  1. В РНК-хеликазах DEAD GAR-домен претерпевал эволюционные изменения вместе с разделением этих белков на подсемейства, что происходило на ранних этапах формирования эукариотической жизни.

  2. Изменения в строении РНК-хеликаз DeaD, связанные с GAR-доменом, тесно связаны с функциями этих белков. В частности, причастность к тем или иным клеточным процессам тесно связано с локализацией белка в том или ином компартменте клетки.

  3. Вероятное функциональное назначение GAR-домена – способность связываться с РНК и выполнять роль сайта распознавания субстрата.



  1. Baserga S. J. Ribonucleoproteins in Archaeal Pre-rRNA Processing and Modification //Archaea. – 2013. – Т. 2013.

  2. Watkins N. J., Bohnsack M. T. The box C/D and H/ACA snoRNPs: key players in the modification, processing and the dynamic folding of ribosomal RNA //Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. – 2012. – Т. 3. – №. 3. – С. 397-414.

  3. Thandapani, Palaniraja; OConnor, Timothy R.; Bailey, Timothy. L.; Richard, Stephane Defining the RGG/RG Motif Molecular cell doi:10.1016/j.molcel.2013.05.021 (volume 50 issue 5 pp.613 - 623)

  4. Ченцов Ю. С. Общая цитология //М.: МГУ. – 1995.

  5. Hickey A. J., Macario A. J. L., Conway de Macario E. Identification of genes in the genome of the archaeon< i> Methanosarcina mazeii
    that code for homologs of nuclear eukaryotic molecules involved in RNA processing //Gene. – 2000. – Т. 253. – №. 1. – С. 77-85.

  6. Shaw P., Brown J. Nucleoli: composition, function, and dynamics //Plant physiology. – 2012. – Т. 158. – №. 1. – С. 44-51.

  7. Aris J. P., Blobel G. cDNA cloning and sequencing of human fibrillarin, a conserved nucleolar protein recognized by autoimmune antisera //Proceedings of the National Academy of Sciences. – 1991. – Т. 88. – №. 3. – С. 931-935.

  8. Iost I., Bizebard T., Dreyfus M. Functions of DEAD-box proteins in bacteria: Current knowledge and pending questions //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms. – 2013. – Т. 1829. – №. 8. – С. 866-877.

  9. Linder P., Jankowsky E. From unwinding to clamping—the DEAD box RNA helicase family //Nature Reviews Molecular Cell Biology. – 2011. – Т. 12. – №. 8. – С. 505-516.

  10. Cordin O. et al. The DEAD-box protein family of RNA helicases //Gene. – 2006. – Т. 367. – С. 17-37.

  11. Byrd A. K., Raney K. D. Superfamily 2 helicases //Frontiers in bioscience (Landmark edition). – 2012. – Т. 17. – С. 2070.

  12. Okanami M., Meshi T., Iwabuchi M. Characterization of a DEAD box ATPase/RNA helicase protein of Arabidopsis thaliana //Nucleic acids research. – 1998. – Т. 26. – №. 11. – С. 2638-2643.


База данных защищена авторским правом ©bezogr.ru 2016
обратиться к администрации

    Главная страница