Гены продукции микроцина escherichia coli S5/98, их экспрессия и влияние на антагонистические свойства рекомбинантных штаммов 03. 00. 23 биотехнология



Скачать 335.53 Kb.
Дата06.05.2016
Размер335.53 Kb.

На правах рукописи


Пантелеева Алиса Анатольевна

ГЕНЫ ПРОДУКЦИИ МИКРОЦИНА Escherichia coli S5/98,

ИХ ЭКСПРЕССИЯ И ВЛИЯНИЕ НА АНТАГОНИСТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ
03.00.23 – биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание

ученой степени кандидата

биологических наук


Боровск – 2006


Диссертационная работа выполнена в

Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова и

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных

Научный руководитель: доктор биологических наук

Алешин Владимир Вениаминович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Рябых Владимир Павлович
кандидат биологических наук

Ботвинко Ирина Васильевна

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН
Защита состоится 7 февраля 2007 г., в 10 часов на заседании

диссертационного совета Д.006.030.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных.



Адрес института: 249013, Калужская область, г. Боровск, п. Институт,

ВНИИФБиП с.-х. животных


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных.

Автореферат разослан “ 2007 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук В.П. Лазаренко




ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Явление антагонизма между бактериями, в большинстве случаев, обусловлено синтезом бактериоцинов (Cursino et al., 2002). В отличие от обычных антибиотиков бактериоцины имеют сравнительно узкий спектр действия, так как активны против бактерий того же вида или родственных видов. Среди бактериоционов кишечных палочек различают колицины и микроцины: они отличаются по химическим свойствам (размеру молекул) и условиям синтеза, которые отражаются на поведении штаммов-продуцентов в микробном сообществе. Интерес к бактериоцинам Escherichia coli связан с важной ролью этой бактерии в качестве компонента микрофлоры кишечника человека и животных. Роль продукции колицинов в обеспечении конкурентоспособности Ecoli в условиях кишечника остается спорной, поскольку они, подавляя рост конкурентов, отрицательно сказываются на жизнеспособности самого продуцента. Экология микробных популяций, в которых присутствуют микроциногенные штаммы, практически не изучена. Весьма актуальным является изучение динамики смешанной микробной популяции, в которой присутствуют продуценты нескольких бактериоцинов и штаммы, различающиеся чувствительностью к ним, так как совмещение в клетке продукции нескольких бактериоцинов с различной регуляцией синтеза, возможно, позволит создать высокоэффективные пробиотические препараты с широким спектром антагонистической активности и увеличить диапазон условий, адекватных их применению.

Препараты на основе кишечной палочки используются в основном для лечения и профилактики дисбактериоза кишечника. В настоящее время в России известные препараты пробиотиков разработаны на основе штамма E. coli М17, который является производным штамма E. coli, используемого для получения препарата «Mutaflor» (Altenhoefer et al., 2004; Grozdanov et al., 2004). Однако, в отличие от исходного штамма, коммерческий штамм E. coli М17 утратил способность к синтезу антибиотических веществ и, следовательно, снизил свою антагонистическую активность в отношении бактерий кишечной группы (Шемчук, 1983). Поэтому оправданы мероприятия по разработке новых пробиотических штаммов или восстановлению антагонистической активности уже существующих штаммов, таких как E. coli M17.


Цель работы. Целью данной работы являлось:

  • изучить влияние продукции антибиотического вещества природного штамма-антагониста E. coli S5/98 на конкурентоспособность бактерий в смешанных культурах in vitro и пищеварительном тракте опытных животных;

  • проверить возможность совмещения детерминант продукции разных бактериоцинов и устойчивости к ним в одном штамме с сохранением продукции этих бактериоцинов;

  • оценить антагонистическую активность изогенных штаммов - производных пробиотического штамма E. coli M17, обусловленную сконструированными рекомбинантными плазмидами ;

  • исследовать динамику производных штамма E. coli M17 в смешанных популяциях in vitro и в природных популяциях;

  • разработать стратегию применения пробиотических штаммов на основе E. coli.

Экспериментальные задачи:

  • клонировать гены, ответственные за продукцию микроцина в перспективном пробиотическом штамме E. coli S5/98 и иммунитет к нему;

  • создать рекомбинантные штаммы, одновременно продуцирующие микроцин штамма E. coli S5/98 и колицин ColE1, или несущие детерминанты устойчивости к нему;

  • провести физиологическую характеристику созданных штаммов в чистых культурах, изучить спектр их бактерицидной активности и устойчивости к собственным и чужеродным бактериоцинам;

  • провести эксперименты по введению созданных штаммов в кишечник телят, изучить их конкурентоспособность и влияние на состав эндогенной микрофлоры;

  • разработать методику количественного определения рекомбинантных штаммов продуцентов бактериоцинов в кишечном содержимом с помощью полимеразной цепной реакции.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В настоящей работе клонирован новый микроцин типа В.

Обнаружено, что сверхэкспрессия некоторых генов хромосомы E. coli обеспечивает устойчивость штаммов E. coli к микроцину типа В.

Впервые на основе родительской плазмиды ColE1 получены новые плазмиды pColdelAp, pPAL2, pPAL3, pPAL4, pPAL5, в том числе плазмиды pPAL4 и pPAL5 с совмещенными детерминантами микроцина В5 и колицина Е1, а также рекомбинантные штаммы – производные пробиотического штамма E. coli M17, содержащие сконструированные плазмиды. Показана возможность совмещения детерминант продукции колицина Е1 и микроцина В5 и устойчивости к ним в одном штамме с сохранением продукции этих бактериоцинов.

Изучена конкурентная динамика природного микроциногенного штамма и полученных рекомбинантных штаммов в искусственных смешанных популяциях, а также в кишечнике опытных животных. Предложена теоретическая модель динамики микроциногенных популяций в гомогенной среде.

Впервые показано, что штамм E. coli, одновременно продуцирующий микроцин и колицин, жизнеспособен в условиях кишечника жвачных животных. Введение этого штамма не оказывает заметного влияния на молочнокислую и бифидофлору кишечника животных, но повышает общее содержание в кишечнике бактерий группы кишечной палочки, подавляя при этом развитие патогенных представителей этой группы.

Предложены стратегии применения пробиотических штаммов, суть которых состоит: 1) в направленном формировании кишечной микрофлоры с первых часов жизни животного; 2) применении искусственно сконструированных штаммов с множественной продукцией антагонистических веществ или комбинированного пробиотического препарата, сочетающего несколько штаммов с различными свойствами, в том числе антагонистическими.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях “4th Joint INRA-RRI Symposium on gut microbiology” (Клермон Феран, Франция) в июне 2004 года и “Plasmid biology 2004” (Корфу, Греция) в сентябре 2004 года, на III Съезде ВОГИС “Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития” в июне 2004 года, докладывались на семинарах НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ. Диссертационная работа была апробирована на открытом заседании отдела эволюционной биохимии НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ 1 ноября 2006 года.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Общий объем диссертации – 122 страницы, включая 16 рисунков и 9 таблиц. Список литературы содержит 180 ссылок, в том числе 23 на русском языке.
ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектами исследования были антагонистический нетоксичный природный штамм E. coli S5/98, выделенный проф. Таракановым Б.В. из желудочно-кишечного тракта свиней в лаборатории биотехнологии микроорганизмов пищеварительного тракта ГНУ ВНИИФБиП сельскохозяйственных животных. В экспериментах по конкурентной динамике микроорганизмов использовались штаммы – продуценты бактериоцинов: E. coli M17 (p74) и E.coli BZB 2283, продуцирующие микроцины С51 и В17 соответственно, которые были любезно предоставлены нам проф. Хмель И.А., заведующей Лаборатории внехромосомной наследственности микроорганизмов Института молекулярной генетики РАН. Для совмещения в одном штамме генов продукции комплекса бактериоцинов мы использовали рекомбинантную плазмиду pColap, немобилизуемую производную плазмиды ColE1 (Лившиц и др., 2000).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Клонирование детерминантов, связанных с продукцией антибиотического вещества природного штамма E. coli S5/98 и иммунностью к нему

Микробиологические исследования природного штамма-антагониста E. coli S5/98 показали, что его антибиотическое вещество представляет собой микроцин типа В. Кроме того, доказано отсутствие экскреции E. coli S5/98 каких-либо других антибиотических факторов.

Исследование устойчивости E. coli S5/98 к антибиотикам (хлорамфеникол – 20 мкг/мл, ампициллин – 50 мкг/мл, канамицин – 20 мкг/мл, стрептомицин – 40 мкг/мл, тетрациклин – 10 мкг/мл) показало отсутствие в этом штамме соответствующих детерминантов устойчивости к антибиотикам.

Выделение ДНК из клеток природного изолята E. coli S5/98 методом щелочного лизиса с модификациями не обнаружило плазмид в этом штамме. Таким образом, синтез микроцина в клетках штамма E. coli S5/98 обусловлен хромосомой или гигантской плазмидой размером свыше 100 т.н.п. Однако, известно, что синтез описанных микроцинов типа В и иммунитет к этим микроцинам связан с генами, находящимися в составе плазмид (Хмель и др., 1999; Destoumieux-Garzon et al., 2002).

Клонирование микроциновых генов и генов иммунности к микроцину осуществляли по методике, основанной на получении банка генов на векторах мини-Mu, соединенных с плазмидным репликоном pMB1 (Groisman, Casadaban, 1986). Для этого были лизогенизированы два штамма: E. coli S5/98 и лабораторный штамм E. coli HB101. На основе лизогенного штамма E. coli S5::Mucts с помощью фаголизата штамма E. coli MC1040 (Mu d5005) был получен двойной лизоген E. coli S5::Mucts (Mud5005). Полученная после термоиндукции двойного лизогена фаговая библиотека была скринирована трансдукцией в штамм E. coli HB101::Mucts с последующей селекцией на чашках, содержащих микроцин штамма E. coli S5/98. Среди трансдуктантов HB101::Mucts (Mud5005), устойчивых к микроцину штамма E. coli S5/98, был отобран один клон E. coli HB101::Mucts(Mud5005-13), который кроме устойчивости к исследуемому микроцину также подавлял рост реципиентного штамма E. coli HB101::Mucts в опытах по отсроченному антагонизму.

Рестриктный анализ фазмиды Mud5005-13 с использованием эндонуклеаз рестрикции HindIII, KpnI, PstI, BglII, EcoRI, MluI, ScaI, XhoI показал, что размер клонированного фрагмента в составе Mud5005-13 превышает 30 т. п. н., и структура ДНК части клонированной последовательности похожа на структуру генетических детерминант микроцина В17.

Фрагмент фазмиды Mud5005-13 размером 860 н.п., полученный в результате ее гидролиза рестриктазой HindIII, мы клонировали в составе плазмиды pUC19 и определили его нуклеотидную последовательность с использованием универсальных плазмидных праймеров. Мы обнаружили гомологию клонированных последовательностей с генами mcbB и mcbC, вовлеченных в продукцию микроцина В17 (рис. 1).

Рис. 1. Структура фазмиды Mud5005-13
Кроме того, определены нуклеотидные последовательности, фланкирующие микроциновые гены в составе фазмиды Mud5005-13. Для этого мы использовали праймеры к векторной части фазмиды Mud5005. При поиске с помощью программы BLAST, обнаружено сходство с генами плазмид энтеробактерий из группы IncFII, которое было наибольшим с открытыми рамками c неидентифицированной функцией yciB и yciA плазмиды R100 (документ в GenBank AP000342). В плазмиде R100 эти гены соседствуют, а в исследуемом штамме E. coli S5/98 они разделены инсерцией, содержащей гены синтеза микроцина и иммунности к нему (рис. 1).

Для минимизации клонированной на Mud5005-13 последовательности микроциновых генов, по сайту EcoRI в вектор pBluescript SK был клонирован фрагмент фазмиды размером около 9 т. п. н., который придавал рекомбинантным бактериям способность продуцировать микроцин типа B, названный нами микроцин В5. Полученная плазмида названа pPAL1 (табл. 2)


2. Анализ структуры клонированного фрагмента

С помощью универсальных плазмидных праймеров была определена первичная структура флангов фрагмента EcoRI плазмиды pPAL1. Их проверка с помощью программы BLAST относительно базы nr показала, что с одной стороны клонированный фрагмент имеет гомологию с последовательностью единственного документа в GenBank X07875, представляющей собой фрагмент природной плазмиды pMccB17, несущей гены иммунности к микроцину B17. Определенный нами фрагмент перекрывается с генами mcbF и mcbG последовательности pMccB17. В этой области у прочитанной нами последовательности имеется две особенности. Первая – наличие одного дополнительного нуклеотида по сравнению с последовательностью X07875, приходящегося на кодирующую рамку mcbF. Этот нуклеотид обеспечивает предсказываемый сдвиг рамки относительно секвенированного ранее гена mcbF в области, близкой к 3' концу гена. В результате 18 C-концевых остатков белка McbF, предсказанного из последовательности X07875, расходятся с предсказанными из определенной нами последовательности. Тогда как в последовательности X07875 гены mcbF и mcbG перекрываются, в нашей последовательности рамка mcbF короче на четыре триплета и гены не перекрываются (рис. 2), а транслируются в одной рамке. Принимая во внимание гомологичность нуклеотидных последовательностей микроцинов типа В, мы допускаем, что в документе X07875 содержится незначительная ошибка. Есть и другие мнения по поводу расхождения в последовательности гена иммунного белка mcbF микроцинов В5 и В17. В настоящее время практически ничего неизвестно об эволюции микроцинов. К микроцинам можно применить механизм эволюции, предложенный для относительно редких нуклеазных колицинов, модификация которых начинается с мутации в гене иммунности, благодаря которой клон с мутантным геном устойчив к собственному колицину, колицину исходного варианта (с интактным геном иммунности) и к некоторым другим похожим колицинам (Riley, Wertz, 2002). Возможно, последние четыре триплета в гене mcbF не влияют на иммунную функцию McbF.


McbF INRYSDMSDFIQSNNETTQKRHLLKKLWEQETDTWI*

+ + + + + + + + + + + + + + + + + +

Frame 2 INRYSDMSDFIQSNNETTPEKAFIKEVMGTGD*HMDIIEKRITKRHLSES



+ + + + + + + + + + + + + + + +

McbG MDIIEKRITKRHLSES

Рис. 2. Фрагмент транслированной в одной из рамок (Frame 2) определенной нами последовательности в сравнении с предсказанными аминокислотами McbF (C-конец) и McbG (N-конец). * – стоп-кодон
Вторая, более существенная особенность субклонированной последовательности из фазмиды Mud5005-13 заключается в том, что в ней ген mcbG не полный: сайт клонирования EcoRI привел к удалению из последовательности 119 триплетов.
3. Субклонирование гена иммунности к микроцину В5

Используя последовательность генов иммунности к типовому микроцину В17 из документа GenBank X07875, мы сконструировали праймеры mcbGd – 5'-atcacaaaacgacacctca-3' и mcbGr + линкер BamHI – 5'-cgcgaattcggatccgtctactcacctcatcccc-3' и амплифицировали с фазмиды Mud5005-13 недостающий фрагмент гена mcbG. Для клонирования мы ввели в один из амплификационных праймеров сайт рестриктазы BamHI, которого не имеется на клонированном фрагменте ДНК, а для интеграции амплифицированного фрагмента в состав частичной последовательности гена mcbG воспользовались уникальным сайтом NruI, расположенным вблизи сайта клонирования EcoRI. Для этого плазмида pPAL1 и амплификат с полной последовательностью гена mcbG были обработаны эндонуклеазами рестрикции NruI и BamHI. Сайт BamHI является уникальным на pPAL1 и находится в составе полилинкера. Сайт BamHI, который, согласно документу GenBank M24253 находится в регуляторной области микроцинового промотора pMccB17, в нуклеотидной последовательности В5 отсутствует. Лигирование полученных фрагментов восстановило полную последовательность генов, связанных с иммунностью к микроцину типа В. Плазмида с полной последовательностью генов, связанных с продукцией микроцина В5 и иммунностью к нему получила название pPAL2 (табл. 2).


4. Устойчивость к микроцину В5

Путем скрининга фаговой библиотеки E. coli S5/98 на векторе Mud5005 были отобраны 15 микроцинустойчивых, но не производящих микроцин клонов, из которых были выделены фазмиды. Проведен рестриктный анализ выделенных фазмид. Все они имеют разный размер и разную рестриктную карту. Трансформация фазмидных ДНК в микроцинчувствительные штаммы, лизогенные по Mucts, показала, что устойчивость к микроцину обусловлена именно фазмидами. Фазмиды из пяти клонов были секвенировны с двух концевых фазмидных праймеров MudR и MudL. Оказалось, что пять встроенных фрагментов являются разными участками хромосомы E. coli K-12, размерами от 9 до 22 т.п.н., последовательности двух из них перекрываются между собой (рис. 3). Судя по результатам рестриктного анализа, действительный размер клонированных последовательностей соответствует размерам соответствующих фрагментов хромосомы E. coli K-12 согласно документу GenBank NC 000913.

Мы провели анализ генетических карт клонированных фрагментов с целью указания генов, повышенная экспрессия которых, предположительно, причастна к устойчивости рекомбинантных бактерий к микроцину типа В.

Неспецифическая устойчивость отобранных клонов к микроцину типа В обеспечивается по-видимому увеличением копий некоторых генов хромосомы E. coli, функции которых можно разделить на три группы: 1) деградация микроцина (продукты генов yhiP и prlC); 2) секреция микроцина (белки EmrA и TolC, продукты генов yjcR и yjcP соответственно); 3) поддержание функционирования репликативного аппарата (priB, recA).




– прочитанные нуклеотидные последовательности фазмид;

– гены хромосомы E. coli, предположительно обеспечивающие устойчивость к микроцину типа В.
Рис. 3. Структура фазмид Mud5005 с детерминантами устойчивости к микроцину типа В
Кроме того, обнаружено, что использование в качестве чувствительной культуры к микроцину В5 штамма E. coli DH5α, мутантного по субъединице А ДНК-гиразы, приводит к появлению устойчивых к этому микроцину бактерий (рис. 4). Известно, что мишенью для микроцинов типа В является С-концевая область субъединицы В ДНК-гиразы. (Vizan et al., 1991; Хмель, 1999). Показано, что точечные мутации в B субъединице ДНК-гиразы, полученные сайт-специфическим мутагенезом, сообщают устойчивость к микроцину В17 (del Castillo et al., 2001). Возможно, мутации в гене субъединицы А ДНК-гиразы уменьшают чувствительность бактерий к микроцину типа В.


Рис. 4. Фотография зоны подавления роста, образованной микроциногенным штаммом E. coli DH5α(pPAL2) на среде ¼ ТА. Чувствительная культура в верхнем слое – E. coli DH5α. Белые «точки» вокруг E. coli DH5α(pPAL2) внутри зоны подавления роста – мутантные клетки, производные штамма E. coli DH5α, устойчивые к микроцину В5



5. Динамика штамма E. coli S5/98 в смешанных культурах

Для селекции штамма E. coli S5/98 в смешанных культурах мы маркировали его детерминантами устойчивости к стрептомицину. Штамм E. coli S5 Sm был получен путем трансдукции в E. coli S5/98 гена rpsL20 из лабораторного штамма E. coli HB101 с использованием P1 фаголизатов (Миллер, 1976).

В качестве индикаторных культур использовали штаммы-продуценты микроцинов С и В и колицина Е1: E. coli M17(p74) – продуцент микроцина С51; E. coli BZB 2283 – продуцент микроцина B17; E. coli TG1(pColap) – продуцент колицина E1.

Для постановки опыта по динамике штамма E. coli S5 Sm в смешанных культурах мы провели эксперимент по перекрестной устойчивости E. coli S5 Sm и индикаторных штаммов (табл. 1). Продукцию микроцина оценивали на среде М9, а колицина – на среде 2YT.

Табл. 1.

Чувствительность штаммов-продуцентов к бактериоцинам, синтезируемым различными культурами



Индикаторные штаммы

Штаммы–продуценты бактериоцинов

E. coli S5 Sm

E. сoli BZB 2283

E. coli M17 (p74)

E. coli TG1 (pColap)

E. coli S5 Sm





+15 мм

+5 мм

E. сoli BZB 2283





+28 мм

+5 мм

E. coli M17(p74)

+18 мм

+20 мм



+3 мм

E. coli TG1(pColap)

+10 мм

+8 мм

+20 мм


Смешанные культуры составляли с учетом скорости роста штаммов. Кривые роста штаммов: E. coli S5 Sm, E. coli M17(p74), E. coli BZB 2283, E. coli TG1(pColap) на богатой и минимальной средах представлены на рис. 5.


А Б

Рис. 5. Кривые роста штаммов E. coli: М17(p74), BZB 2283, S5 Sm и TG1(pColap). А на минимальной среде (М9); Б на богатой среде (2YT)


Отдельно взятая смешанная культура была составлена из двух штаммов: E. coli S5 Sm и одного из индикаторных штаммов в соотношении 1:2 соответственно. Эксперименты проводили на богатой (2YT) и минимальной ( M9) средах. Всего было исследовано три варианта смешанных культур:

E. coli S5 Sm : E. coli TG1(pColap);

E. coli S5 Sm : E. coli М17(p74);

E. coli S5 Sm : E. coli BZB 2283.

На среде 2YT смешанные культуры тестировали через 3, 8, 26, 38 и 54 часа с начала культивирования. Пересев культур в свежие среды производился одни раз через 26 часов после начала опыта. При этом в каждую пробирку с 5 мл свежей среды 2YT вносили по 40 мкл смешанных культур.

На среде М9 смешанные культуры тестировали через 24, 48, 72 и 96 часов с начала культивирования. Пересев культур в свежие среды не производили.

Количество клеток штамма E. coli S5 Sm определяли путем перекалывания колоний, выросших на среде без антибиотика, на селективную среду, содержащую стрептомицин.

В опыте по перекрестной устойчивости E. coli S5 Sm и индикаторных штаммов было показано, что E. coli S5 Sm чувствителен к некоторым из них. Однако, в смешанных культурах за счет микроциногении и высокой скорости роста E. coli S5 Sm быстрее других выходит в стационарную фазу роста, во время которой и происходит активный синтез микроцина, оказывающего бактерицидное действие на индикаторные культуры (рис. 6).

А Б

Рис. 6. Жизнеспособность штамма E. coli S5 Sm в смешанных культурах, %. А – на богатой среде (2YT); Б – на минимальной среде (М9).


Интересна конкурентная динамика штаммов в условиях богатой среды. Сразу же после инокуляции штаммов происходит стремительное увеличение численности клеток штамма E. coli S5 Sm. За первые три часа культивирования относительное содержание клеток штамма E. coli S5 Sm во всех вариантах смешанных культур увеличивается от исходного значения 33% до 70% и больше. При этом изменение в соотношении каждой пары конкурирующих штаммов обусловлено только лишь преимуществом в скорости роста E. coli S5 Sm. При замедлении роста смешанных культур это соотношение начинает меняться в обратную сторону для всех трех пар штаммов. По-видимому, на этом этапе проявляется антагонистическая активность штаммов, обусловленная синтезом бактериоцинов. Синтез бактериоцинов индуцируется увеличением плотности культуры, начиная с конца логарифмической фазы роста. Постепенное уменьшение относительного содержания клеток штамма E. coli S5 Sm продолжалось до тех пор, пока смешанные культуры не были пересеяны в свежую среду. Известно, что для активности колицина необходима высокая концентрация колициновых молекул в среде от 140 молекул до 2400 молекул колицина Е1 на клетку и выше в зависимости от эффективности связывания колициновых молекул рецепторами чувствительных клеток. Кроме того, одна летальная единица колицина Е1 составляет в среднем 100 молекул, связанных с бактериальной клеткой (Farid-Sabet, 1982). Известно также, что синтез колицина Е1 характеризуется низкой продукцией колициновых молекул из расчета на одну клетку (Gordon, Riley, 1999). Резкое снижение концентрации колицина E1 штамма E. coli TG1(pColap), из-за пересева смешанной культуры, а также высокая скорость роста штамма E. coli S5 Sm изменяют картину конкуренции между этими двумя штаммами. Увеличение соотношения штаммов E. coli TG1(pColap) и E. coli S5 Sm в пользу последнего происходит до тех пор, пока в среде культивирования не накопится достаточное количество колициновых молекул для бактерицидного действия колицина Е1 штамма E. coli TG1(pColap). Кроме того, богатая среда способствует накоплению колицина.

Для бактерицидного действия микроцина достаточно небольшой его концентрации. Минимальная ингибирующая концентрация микроцина типа С составляет меньше 0,5 мг/л (Baquero, Moreno, 1984). Видимо поэтому пересев смешанной культуры штаммов E. coli М17(p74) и E. coli S5 Sm в свежие среды никак не отражается на ее динамике. Штамм E. coli М17(p74) подавляет штамм E. coli S5 Sm до полного исчезновения последнего.

Интересна также динамика популяции, состоящей из двух штаммов E. coli S5 Sm и E. сoli BZB 2283 с одинаковым типом бактериоцинов. При описанной выше перекрестной устойчивости этих штаммов друг к другу наблюдается преобладание штамма E. coli S5 Sm над штаммом E. сoli BZB 2283. Совершенно очевидно, что антагонистическая активность не имеет отношения к конкурентной динамике в этой искусственной популяции и соотношение штаммов с одним типом бактериоцина зависит от скорости роста конкурирующих штаммов, а также от внутриклеточных характеристик, таких как уровень экспрессии плазмидных генов, регуляция числа копий в клетке, стабильность репликонов и других.

В проведенном эксперименте остается неясным, есть ли вклад бактериоциногении в динамику смешанных популяций на минимальной среде, или же конкурентоспособность штамма E. coli S5 Sm обусловлена только лишь высокой скоростью роста. Как видно из рис. 6, на бедной среде штамм E. coli S5 Sm доминирует во всех опытных вариантах.

Анализируя результаты эксперимента по изучению поведения природного изолята E. coli S5/98 в смешанных культурах, можно сказать, что, итог конкуренции штаммов обусловлен не только бактериоцинами, так как в этом эксперименте использовались гетерогенные культуры, отличающиеся многими свойствами, например, скоростью роста. Известно, что различные вещества, экскретируемые клетками, выполняют коммуникативные функции. Одни и те же экзометаболиты по-разному действуют на разные штаммы: индуцируют рост одного штамма, поддерживают культуру клеток этого штамма в условиях голодания, но при этом ингибируют рост другого штамма (Vakhitov, Petrov, 2006).

Таким образом, изучение антагонистической активности штаммов, обусловленной бактериоцинами, необходимо проводить в изогенных штаммах с идентичным спектром экзометаболитов, и одинаковыми векторными системами, экспрессирующими гены антибиотиков.

В связи с этим появилась необходимость клонировать нуклеотидную последовательность, отвечающую за синтез микроцина штамма E. coli S5/98.
6.1. Конструирование векторов

Для совмещения в одном штамме генов продукции микроционов и колицинов мы воспользовались плазмидой pColap, полученной ранее немобилизуемой производной плазмиды ColE1 (Лившиц и др., 2000). Однако в ходе наших экспериментов была обнаружена плохая выживаемость штамма E. coli S 5/98 (pColap). Мы предполагаем, что это связано с усиленной индукцией колициновых генов в этом штамме, что ведет к гибели большого числа клеток. Для проверки этого предположения и устранения негативных последствий мы с помощью рестриктаз PstI и StuI удалили ген cea, а вместе с ним и другие гены, необязательные для репликации плазмиды pColap. Полученная плазмида названа pColdelAp (рис. 7).

Затем в сайт NruI плазмиды pColdelAp, локализованный в последовательности гена kil, встроили ген устойчивости к канамицину, который предварительно был вырезан из плазмиды pUC4K с помощью рестриктазы HincII. Полученная плазмида pPAL3 обеспечивает реципиентным клеткам иммунность к колицину E1, но не обеспечивает продукции колицина, однако и не приводит к гибели клеток, связанной с такой продукцией.

Таким образом, мы имеем две векторные плазмиды, одна из которых обеспечивает продукцию колицина E1 (pColap), а другая – только иммунность к нему (pPAL3).


Рис. 7. Конструирование плазмид pColdelAp и pPAL3
6.2. Конструирование плазмид с генами бактериоцинов двух типов

Для манипуляций с клонированными генами микроцина B5 в плазмиду pPAL2 был введен второй сайт BamHI. Для этого в уникальный сайт XhoI плазмиды pPAL2 после тупления выступающих концов был встроен линкер BamHI. Фрагмент, содержащий полную последовательность генов микроцинового оперона, была вырезан с помощью рестриктазы BamHI и встроен в векторы pColap и pPAL3. Для этого в уникальный сайт MluI векторов pColap и pPAL3 после тупления концов был введен синтетический линкер BamHI (рис. 8).

Таким образом, были получены рекомбинантные плазмиды pPAL4 и pPAL5, несущие детерминанты антибиотических веществ двух типов: микроцина и колицина.

Рис. 8. Конструирование плазмид pPAL4 и pPAL5

Табл. 2


Свойства рекомбинантных плазмид

Плазмида

Генетические признаки

Свойства

pColap

cea–kil(СolE1), imm(СolE1), exc, Apr

продукция колицина E1, устойчивость к колицину Е1 и ампициллину

pColdelAp

kil(СolE1), imm(СolE1), Apr

устойчивость к колицину Е1 и ампициллину

pPAL1

mcbABCDEF, Apr

продукция микроцина В5, частичная устойчивость к микроцину В5, устойчивость к ампициллину

pPAL2

mcbABCDEFG, Apr

продукция микроцина В5, устойчивость к микроцину В5 и ампициллину

pPAL3

imm(colE1), Kmr, Apr

устойчивость к колицину Е1, канамицину и ампициллину

pPAL4

cea–kil(СolE1), imm(СolE1), exc, Apr, mcbABCDEFG

продукция колицина E1, устойчивость к колицину Е1, продукция микроцина В5, устойчивость к микроцину В5 и ампициллину

pPAL5

imm(СolE1), Kmr, Apr, mcbABCDEFG

устойчивость к колицину Е1, продукция микроцина В5, устойчивость к микроцину В5, ампициллину и канамицину



7. Исследование поведения рекомбинантных штаммов кишечной палочки – продуцентов комплекса антибиотических факторов in vitro

Для изучения свойств полученных векторов мы трансформировали их в пробиотический штамм E. coli M17. Тем самым, была получена коллекция четырех изогенных штаммов: E. coli М17(pColap); E. coli М17(pPAL3); E. coli М17(pPAL4); E. coli М17(pPAL5). Штаммы E. coli М17(pPAL4) и E. coli М17(pPAL5) несут генетические детерминанты сразу двух типов бактериоцинов: микроцина В5 и колицина Е1, совмещенных на одном репликоне.

Предварительно была проверена перекрестная устойчивость полученных штаммов на разных средах культивирования и сегрегационная стабильность плазмид.

Из полученных данных (табл. 3) следует, что все рекомбинантные штаммы на основе E. coli M17 ингибируют рост своего бесплазмидного реципиента. Они также угнетают рост индикаторной культуры E. coli DH5. По результатам опыта можно сказать, что в штаммах–продуцентах двух антибиотических факторов, экспрессия колицина не влияет на продукцию микроцина. Кроме того, совмещение продукции микроцина и колицина в одном штамме позволяет получать стабильно микроциновые зоны подавления роста индикаторных культур на богатой среде (TA).


Табл. 3


Перекрестная устойчивость штаммов E. coli М17, E. coli М17(pColap);

E. coli М17(pPAL4); E. coli М17(pPAL5)

Индикаторные штаммы

Штаммы-продуценты бактериоцинов

E. coli М17(pPAL4)

E. coli М17(pPAL5)

E. coli M17

E. сoli M17(pColap)

E. coli DH5

(¼ TA) +16 мм

(TA) +12 мм



(¼ TA) +16 мм



(1/4 TA) —


(TA) +3 мм

E. coli М17(pPAL4)

(¼ TA) —

(TA) —


(¼ TA) —

(TA) —




(TA) —

E. coli М17(pPAL5)

(¼ TA) —

(TA) —


(¼ TA) —

(TA) —





(TA) —


E. coli M17

(¼ TA) +11 мм

(¼ TA) +11 мм



(1/4 TA) —

(TA) +2 мм



E. сoli M17(pColap)

(¼ TA) +11 мм

(¼ TA) +11 мм



(TA) —

В скобках указана среда, на которой появляется указанная зона подавления роста; « + » – подавление роста; « — » – отсутствие подавления роста.
Путем пересева клеток полученных штаммов в неселективных условиях в течение 7 суток на богатой (2YT) и бедной (М9) жидких средах, установлена высокая стабильность полученных конструкций, которая обеспечивается репликоном, а также антибиотической селекцией против клеток, утративших плазмиду с генами иммунности.

Также мы трансформировали рекомбинантные плазмиды pColap, pPAL2, pPAL3, pPAL4, pPAL5 в штамм E. coli DH5α. На рис. 9 видны зоны подавления роста, образованные штаммами E. coli DH5α(pPAL4), E. coli DH5α(pPAL5), E. coli DH5α(pColap) на среде 2YT. Индикаторная культура в верхнем слое – штамм E. coli DH5α. Штамм-продуцент микроцина В5 E. coli DH5α(pPAL2) не образует зону подавления роста индикаторной культуры на богатой среде 2YT. На рис. 9 видно, что совмещение детерминантов продукции и иммунности микроцина В5 и колицина Е1 в штаммах E. coli DH5α(pPAL4) и E. coli DH5α(pPAL4) не препятствует продукции микроцина В5 на богатой среде. О продукции колицина Е1 штаммом E. coli DH5α(pPAL4) косвенно свидетельствует отсутствие резистентных мутантов в зоне подавления роста индикаторной культуры, наблюдавшихся в случае микроцину В5 как единственного антагонистического фактора (ср. рис. 4 и 9). Зоны подавления роста у штаммов с совмещенной продукцией микроцина В5 и колицина Е1 выглядят как микроциновые. Они широкие (11-30 мм), имеют размытую границу, но, в отличие от последних, характеризуются отсутствием мутантных бактерий. Колициновые зоны с ровным четким краем и радиусом 2-5 мм.



Рис. 9. Фотографии чашки с зонами подавления роста, образованные штаммами E. coli DH5α(pColap), E. coli DH5α(pPAL4) и E. coli DH5α(pPAL4) (комментарии в тексте)



7.1. Динамика популяций штаммов производных E. coli M17 в смешанных культурах

В смешанные культуры было взято одинаковое количество клеток штаммов E. coli М17, E. coli М17(pPAL4) и E. coli М17(pPAL5). В каждый опытный вариант на 5 мл среды брали по 20 мкл ночных культур. Эксперимент проводили на богатой (2YT) и минимальной (M9) средах. Состав смешанных культур определяли через 4 (2YT) и 6 (M9) часов и на 1, 2, 3, 6, 10 сутки от начала культивирования. Пересев культур в свежие среды производили один раз на 3 сутки после начала опыта. Количество клеток каждого штамма определяли путем перекалывания колоний, выросших на среде без антибиотика на селективную среду, содержащую маркерный антибиотик ампициллин. При этом клетки E. coli, не выросшие на селективной среде, считались исходным бесплазмидным штаммом E. coli М17.

На рис. 10А видно, что исходный штамм E. coli M17 не обнаруживается в смешанной культуре уже через сутки культивирования. Низкая жизнеспособность E. coli M17 обусловлена его чувствительностью к колицину Е1 штамма E. coli М17(pPAL4) и микроцину В5 штаммов E. coli М17(pPAL4) и E. coli М17(pPAL5). Штамм E. coli М17(pPAL5) не производит колицин, но обладает устойчивостью к нему. Этим, по-видимому, объясняется равное соотношение штаммов, содержащих рекомбинантные плазмиды, в первые сутки культивирования. Затем это соотношение изменяется в сторону доминирования штамма E. coli М17(pPAL5) над E. coli М17(pPAL4). Известно, что синтез колицина сопряжен с лизисом клеток продуцентов. Таким образом, в культуре постоянно происходит гибель некоторого количества клеток E. coli М17(pPAL4), связанная с продукцией колицина, аналогичной убыли клеток E. coli М17(pPAL5) не предполагается. Количество колицина, образующегося в популяции продуцента, определяется количеством этого бактериоцина, которое необходимо для подавления роста или исчезновения штаммов конкурентов. Кроме того, в штамме E. coli М17(pPAL4) микроцин В5 помимо своей высокой бактерицидной активности, запуская SOS–ответ клетки (Herrero, Moreno, 1986) выступает в роли индуктора синтеза колицина Е1. Известно, что синтез колицина Е1 индуцируется условиями или факторами, запускающими SOS–ответ клетки, который в свою очередь инактивирует репрессор колицинового оперона белок LexA. В штамме E. coli М17(pPAL5) отсутствует продукция колицина, запускающего механизм преждевременной гибели клеток. Устойчивость к колицину штамма E. coli М17(pPAL5) и богатая среда обеспечивают активный синтез колицина в штамме E. coli М17(pPAL4), усиливая лизис клеток последнего.

А Б

Рис. 10. Диаграммы, отражающие выживаемость и соотношение клеток штаммов E. coli M17, E. coli М17(pPAL4); E. coli М17(pPAL5) в смешанной культуре на богатой среде (2YT) (А) и на минимальной среде М9 (Б)


На бедной среде (рис. 10Б), также как и на богатой, происходит полной исчезновение исходного штамма E. coli M17 в смешанной культуре в течение первых 24 часов культивирования. Однако соотношение двух других штаммов E. coli М17(pPAL5) и E. coli М17(pPAL4) со временем изменяется в пользу колициногенного. Причины этого не ясны. Обычно, иммунный белок к колицину Е1 в клетке синтезируется конститутивно, и его количества достаточно для защиты клеток от эндогенного и экзогенного колицина. Однако имеются сообщения, что экспрессия оперона ceakil регулируется уровнем транскрипции гена imm, чья последовательность перекрывается с генами ceakil, но транскрипция происходит в противоположном направлении (Zhang et al., 1988; Bishop et al., 1985). Возможно, имеет место обратный эффект. В отсутствии оперона ceakil на плазмидах, трансляция imm мРНК частично подавлена контртранскриптом, образующимся с промотора генов cea-kil, сохранившегося в составе pPAL5. Однако, скорее всего, в неблагоприятной для синтеза колицина бедной культуральной среде колициногения не играет роли в конкуренции между штаммами. Это предположение основано на результатах эксперимента по перекрестной устойчивости штаммов на среде М9 (табл. 3).

Применяя к этому эксперименту существующие теоретические модели динамики смешанной бактериальной культуры, в которой взаимодействуют штамм–продуцент колицина и чувствительный к этому колицину штамм, можно сказать, что штамм E. coli M17 обладает преимуществом перед штаммами E. coli М17(pPAL5) и E. coli М17(pPAL4), так как не расходует ресурсы на синтез бактериоцинов и обеспечение иммунности к ним. Антагонистическая активность штаммов E. coli М17(pPAL5) и E. coli М17(pPAL4) в отношении чувствительной культуры штамма E. coli M17 при замедлении роста популяции говорит о том, что она обусловлена вторичными метаболитами. Бактериоциновая природа этой активности подтверждается тем, что 24-х часовая смешанная культура почти не содержит штамма E. coli M17, тогда как изогенные штаммы продуценты микроцина В5 и колицина Е1 в присутствуют в равном соотношении. Учитывая различающиеся стратегии синтеза этих двух бактериоцинов, можно ожидать, что подавление чувствительной культуры на богатой среде в первую очередь обусловлено бактерицидным действием колицина Е1, а на бедной микроцином В5. Однако, вполне вероятно, что в условиях неструктурированной среды и на богатой и на бедной средах чувствительный штамм E. coli M17 погибает вследствие «кинетики одного удара» микроцина В5. Известно, что в отличие от колицина Е1, для активности микроцина не требуется большого количества его молекул, и продукция микроцина В5 не сопряжена с гибелью клеток–продуцентов. На рис. 10А видно, что в 24-х часовой смешанной культуре на богатой среде, способствующей синтезу колицина Е1, после антагонистической активности в отношении чувствительной культуры E. coli M17 продуцент колицина штамм E. coli М17(pPAL4) и устойчивый к колицину штамм E. coli М17(pPAL5) присутствуют в равных соотношениях. Это косвенно указывает на то, что инструментом антагонистической активности в данном случае был бактериоцин, синтез которого не сопряжен с лизисом клеток-продуцентов, а именно микроцин В5. Кроме того, результаты эксперимента по перекрестной устойчивости изогенных рекомбинантных штаммов E. coli М17 (табл. 3) показали, что совмещение продукции микроцина B5 и колицина E1 в штамме E. coli М17(pPAL4) позволило получить стабильные микроциновые зоны подавления роста индикаторных культур на богатой среде (ТА).

Таким образом, в связи с утратой пробиотическим штаммом E. coli M17 антагонистических свойств мы предлагаем восстановить его конкурентоспособность с помощью рекомбинантных плазмид, детерминирующих продукцию двух бактериоцинов (микроцина В5 и колицин Е1), а также устойчивость к ним.

Полученные плазмиды восстанавливают утраченные антагонистические свойства штамма E. coli M17. Это позволит создать пробиотические препараты с повышенной антагонистической активностью и эффективные на фоне приема антибиотиков.

Предполагается, что искусственно сконструированные штаммы, сочетающие генетические детерминанты продукции антагонистических веществ обоих типов (колицинов и микроцинов) будут обеспечивать высокий уровень антагонизма пробиотического препарата против природных энтеропатогенных штаммов независимо от типов кормления сельскохозяйственных животных.

Как вариант применения сконструированных плазмидных векторов, разработана схема удаления генов устойчивости к антибиотикам: ампициллину и канамицину. Таким образом, для получения пробиотических препаратов возможно использование разных производных полученных плазмид.


9. Эксперименты на животных

Полученные в этой работе штаммы использовались в экспериментах на животных, проводимых совместно с сотрудниками лаборатории биотехнологии микроорганизмов пищеварительного тракта ГНУ ВНИИФБиП сельскохозяйственных животных РАСХН под руководством проф. Б.В. Тараканова. Для продуцента микроцина В5 E. coli S5 Sm и продуцента двух бактериоцинов: колицина Е1 и микроцина В5 E. coli S5(pColap) показана длительная персистенция в пищеварительном тракте жвачных животных с установившимся типом рубцового пищеварения и подавление ими лактозоотрицательных штаммов E. coli и Salmonella spp., а также достоверное увеличение титров энтерококков. Однако в опытах с телятами–молочниками отмечена низкая эффективность воздействия этих штаммов на кишечную микрофлору (Тараканов и др., 2003). В случае штамма E. coli S5 Sm быстрая элиминация из популяции, по-видимому, обусловлена подавлением синтеза микроцина в богатой среде кишечного содержимого телят, находящихся на молочном вскармливании. Низкая инвазивная способность колициногенного штамма E. coli S5(pColap) скорее всего обусловлена повышенным уровнем продукции колицина в этом штамме, которая сопряжена с лизисом клеток-продуцентов.

Исходя из результатов опытов на животных, в которых участвовали штаммы E. coli S5 Sm и E. coli S5(pColap), для следующего эксперимента был выбран микроциногенный штамм E. coli М17 (pPAL5), устойчивый к колицину Е1. Было проведено два опыта по одной и той же схеме, в каждом из которых участвовало по три теленка. Количество клеток E. coli в кишечном содержимом определяли перед применением препарата (фоновое содержание), в последний день приема (4-х суточный прием) и на 1, 3 и 5 дни отмены препарата.

Учет производили высевом на селективную для кишечных палочек среду Эндо без антибиотиков, а также среду Эндо с ампициллином (50 мкг/мл) и канамицином (50 мкг/мл) для обогащения штаммом E. coli М17 (pPAL5). Колонии E. coli М17 (pPAL5), выросшие на среде с антибиотиками, диагностировали ПЦР с помощью праймеров к структурной части микроциновых генов 5'-gca gca acg gtt gta gtg gt-3' и 5'-gtc aac tcc tga agt cgc cg-3'. При расчете учитывали долю антиботикорезситентных бактерий в общем титре Escherichia.

Установлено, что задаваемый микроциногенный штамм E. coli М17 (pPAL5) сохраняется, по меньшей мере, до пяти суток в пищеварительном тракте телят (табл. 4). При этом наблюдается очень большая дисперсия в его содержании: от долей процента до 60% от всех выделенных Escherichia.

Табл. 4


Относительное содержание клеток штамма E. coli М17(pPAL5) в кишечном содержимом телят




теленок №1

теленок №2

теленок №3

4-х дневная дача препарата

5,0%

17,0%

55,8%

1-ый день отмены

2,6%

0,3%

65,4%

3-ий день отмены

0,4%

0,4%

32,8%

5-ый день отмены

6,0%

0,2%

60,0%

У разных животных также отличается динамика изменения численности задаваемого штамма: она либо поддерживается на стационарном (высоком или низком) уровне (животные № 1 и 3), либо происходит резкое снижение титра сразу после отмены препарата (теленок № 2). Можно предполагать, что эти различия связаны с особенностями резидентной микрофлоры каждого животного, которая, таким образом, оказывается значительной.



Для практических целей применения живых культур микроорганизмов можно рекомендовать разработку двух стратегий. По одной из них необходимо направленное формирование микрофлоры с первых часов жизни, которое уменьшит гетерогенность животных по этому показателю и сделает более предсказуемым динамику численности пробиотических штаммов в пищеварительном тракте. Альтернативная стратегия может быть основана на признании начальной гетерогенности конкурентных условий в пищеварительном тракте отдельных животных и, соответственно, слабой предсказуемости результатов приживаемости того или иного задаваемого штамма. В этом случае выход может состоять в применении искусственно сконструированных штаммов с множественной продукцией антагонистических веществ или комбинированного пробиотического препарата, сочетающего несколько штаммов с различными свойствами, в том числе антагонистическими, с тем, чтобы наиболее конкурентоспособный в данных условиях штамм колонизировал кишечный тракт.
ВЫВОДЫ


  1. Клонирован кластер генов из штамма E. coli S5/98, ответственный за продукцию микроцина В5 и иммунитет к нему. В его составе выявлены ключевые гены, детерминирующие биосинтез В5 и устойчивость к нему. На флангах кластера обнаружены последовательности, гомологичные плазмидам IncFII энтеробактерий. Таким образом, установлено плазмидное происхождение микроцина В5.

  2. Показано наличие у штаммов E. coli множественных диспергированных по геному локусов, способствующих устойчивости к микроцину типа В. Предложено участие продуктов генов yhiP и prlC в деградации микроцина типа В, белков EmrA и TolC в его секреции, а белка PriB в поддержании функционирования репликативного аппарата в присутствии микроцина типа В.

  3. Показана возможность совмещения детерминант продукции колицина Е1 и микроцина В5 и устойчивости к ним в одном штамме с сохранением продукции этих бактериоцинов.

  4. Доказано, что синтез бактериоцинов является оружием в конкуренции между штаммами и способствует выживанию бактерий в микробных сообществах. Установлено, что в неструктурированной среде не может поддерживаться полиморфизм продуцентов бактериоцина и чувствительных к этому бактериоцину штаммов. Скорость вытеснения чувствительной культуры из популяции определяется типом бактериоцина: для микроциногенных штаммов она выше, чем для колициногенных. Предложена теоретическая модель динамики микроциногенных популяций в гомогенной среде.

  5. Впервые показано, что штамм E. coli, одновременно продуцирующий микроцин и колицин, жизнеспособен в условиях кишечника жвачных животных. Введение этого штамма не оказывает заметного влияния на молочнокислую и бифидофлору кишечника животных, но повышает общее содержание в кишечнике бактерий группы кишечной палочки, подавляя при этом развитие патогенных представителей этой группы.

ПУБЛИКАЦИИ АВТОРА ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ


  1. Яковлева А.А., Алешин В.В., Тараканов Б.В. Длинные прямые повторы в составе искусственной плазмиды pLF5 как фактор сбалансированной структурной нестабильности. Актуальные проблемы биотехнологии в животноводстве. Тезисы докладов. Боровск: Издательство ВНИИФБиП с.-х. животных. 2000. С. 449-450.

  2. Яковлева А.А., Алешин В.В., Тараканов Б.В. Структурная нестабильность некоторых искусственных плазмид и гетерологичная экспрессия с их промотора. Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. 2001. Т. 2. С. 33-36.

  3. Тараканов Б.В., Яковлева А.А., Николичева Т.А, Комкова Н.М., Манухина А.И., Алешин В.В. Вектор pLF22 для экспрессии генов молочнокислых бактерий. Микробиология. 2004. Т. 73. № 2. 170-175.

  4. Тараканов Б.В., Яковлева А.А., Алешин В.В. Характеристика энтеробактерий, продуцирующие низкомолекулярные антибиотики микроцины. Микробиология. 2004. Т. 73. № 2. С. 150-155.

  5. Яковлева А.А., Тараканов Б.В., Алешин В.В. Новый микроцин типа В и неспецифическая устойчивость к нему. Тезисы докладов III Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития». Москва. 6-12 июня 2004. Т. 1. С. 367.

  6. Тараканов Б.В., Алешин В.В., Николичева Т.А., Комкова Н.М., Полякова Л.Л., Яковлева А.А. Исследование закономерностей формирования микробиоты кишечного тракта сельскохозяйственных животных под воздействием пробиотических штаммов – продуцентов микроцинов. Труды регионального конкурса научных проектов в области естественных наук. Калуга: Эйдос. 2004. Вып. 5.

  7. Yakovleva A.A., Aleshin V.V., Tarakanov B.V. New B-type microcin and non-specific resistance to it. Reproduction, Nutrition, Development. 2004. Vol. 44. Suppl. 1. “4th joint INRA-RRI Symposium on gut microbiology”, special issue.

  8. Yakovleva A.A., Aleshin V.V. Structural non-stability of some pLF plasmids and heterologous expression from their promoter. Plasmid. 2005. V. 53. № 1. P 75.




База данных защищена авторским правом ©bezogr.ru 2016
обратиться к администрации

    Главная страница