Ген зеленого флуоресцирующего белка и исследование центральной нервной системы



Скачать 52.74 Kb.
Дата15.11.2016
Размер52.74 Kb.
Ген зеленого флуоресцирующего белка

и исследование центральной нервной системы

Дудуния Т.Т.

Научные руководители – к.м.н., старший преподаватель Клыков А.И.,

к.м.н., старший преподаватель Фролова Н.А.

Кафедра анатомии человека СГМА, кафедра медицинской микробиологии СГМА


Исследование проводящих путей является одним из важнейших направлений в нейрофизиологии и анатомии. Заложенные в 19-м веке немецким анатомом Карлом Фридрихом Бурдахом эти исследования продолжают развиваться и в настоящее время. Однако, даже сейчас не все вопросы локализации и функций проводящих путей известны достаточно полно. Новые перспективы по изученью данных вопросов открывает использование новейших достижений в биотехнологии, в частности – GFP-трансгенных животных. Созданные около пяти лет назад, эти живые организмы имеют активный ген GFP (green fluorescent protein), ген зеленого флуоресцирующего протеина, способный интегрироваться в различные клетки организма и синтезирующий светящиеся белки [2].

Цель исследования - на основе имеющихся литературных данных дать обзор перспективам применения гена GFP для исследования центральной нервной системы и проводящих путей головного и спинного мозга.

Результаты исследования и их обсуждение

По своей химической структуре GFP – протеин, состоящий из 238 аминокислот с весом 26,9 кДа и бочкообразной конформацией с центрально расположенным хромофором [1,5].

Впервые «дикий», природный, тип этого протеина был выделен в 60-е годы прошлого века из медузы вида Aequorea victoria. Пионерами в этих исследованиях были Осаму Шимомура и Франк Джонсон, работавшие в Университете Вашингтона, которые опубликовали результаты своих работ в 1962 году. Предположительно, ген, кодирующий этот белок, возник в природе более 160 миллионов лет назад. Белок, кодируемый данным геном был назван GFP [3]. Главная его особенность – способность испускать зеленоватое свечение с длиной волны 508 нм при подсветке его синим светом. В природе у медуз Aequorea victoria данный белок светится при поглощении синего цвета, испускаемым другим светящимся белком – акворином. Тем не менее, это открытие оставалось невостребованным для молекулярной биологии до 1992 года. В этом году Дуглас Прэшер представил результаты расшифровки генома данного протеина и доказал возможность его клонирования. Из-за недостатка финансирования он в дальнейшем вынужден был закрыть свою лабораторию, но перед этим он разослал ДНК с закодированным в ней белком GFP в ряд лабораторий и уже в 1994 году Мартин Чалфи интегрировал данный ген в геномы E. coli и C. elegans [2].

Тем не менее, GFP имел ряд недостатков, такие как чувствительность к изменению рН, недостаточную фотоустойчивость и термостабильность. Поэтому стали проводится исследования по воздействию на «дикий» тип гена различными мутагенами. Первая мутация, полезная с практической точки зрения, была получена в 1995 году Роджером Тшином [6]. Благодаря точеченой мутации GFP его спектральные характеристики значительно улучшились, усилилась яркость свечения. В том же году Оле Тхастрап представил свой вариант мутантного GFP, что дало возможность в дальнейшем использовать этот белок как флуоресцентную метку в клетках млекопитающих. Следует отметить, что данные изменения GFP так же осуществились при точечном типе мутаций гена. Создание в конце прошлого, начале нашего века другой группы мутаций было направлено на изменение цвета свечения GFP. Были получены варианты с синим, голубым, красным, оранжевым и желтым свечением [1].

GFP ген был внедрен во многие организмы: бактерии, дрожжи, грибы, рыбы, растения, клетки млекопитающих, в том числе и человека.

Внедрение гена GFP в клетку-хозяина возможно при использовании подходящего переносчика (вектора) ДНК – вируса или плазмиды. При этом применяется два способа переноса данного гена. При первом (быстротекущий вариант) плазмидная или вирусная ДНК вводится в клетку-хозяина, но не интегрируется в хромосомы. При этом ген экспрессируется в цитоплазме клетки-хозяина в течении короткого времени. В клетках млекопитающих свечение при этом методе можно наблюдать уже через несколько часов. Флюоресценция длится от 72 до 96 часов. При второй методике (стабильный вариант) ДНК плазмиды интегрируется в геном нужной клетки. В обоих случаях геном плазмиды должен содержать нуклеотидную последовательность репликации бактериальной ДНК, эукариотические генетические последовательности для начала синтеза информационной РНК, ген полиаденилирования, ген встраивания в клетку млекопитающих и ген антибиотикорезистентности. Эти элементы нужны для начала синтеза необходимого флюоресцирующего белка и устойчивости плазмиды в клетке-хозяине. Выпускаются коммерческие варианты уже готовых плазмид для тех или иных клеток и их органелл, например, фирмой Clontech Laboratories, Inc [3].

Для амплификации плазмидных векторов используются специальные линии мутированных бактерий – компетенты. Набор мутаций этих бактерий обеспечивает им способность воспроизводить плазиды-векторы. Так же данные бактериальные клетки имеют высокую проницаемость клеточной стенки (обычно индуцированной химически) для внесения ДНК с флюоресцирующим геном через клеточную стенку в бактерию. После внесения нужной ДНК бактерии растут на различных средах с добавлением тех антибиотиков, к которым у них есть устойчивость, обеспечиваемая геномом плазмиды. Это нужно для подавления роста других микроорганизмов. Выросшая культура бактерий центрифугируется, затем лизируется с применением энзимов, разрушающих РНК. Лизат фильтруется и помещается в ионообменную колонку. В ней происходит разделение на плазмидную ДНК и ненужные компоненты (РНК, белки и т.д). Нужная плазмидная ДНК центрифугируется, промывается и растворяется в буферном растворе. Следующий этап – внедрение плазмидной ДНК с геном флюоресценции в клетку-хозяина. Для этого применяется ряд процедур, в том числе и липофекция. Это широко распространенный вследствие своей надежности метод. При данном методе плазмидная ДНК помещается в липидную везикулу и внедряется путем эндоцитоза в клетку-хозяина. В ее цитоплазме липидная оболочка эндосомы растворяется и из нее выходит плазмидная ДНК. Так же используется и метод электропорации. При этом под воздействием электрических разрядов на клетки-хозяева в их мембранах формируются поры для прохождения плазмидной ДНК [3,4].

Наибольший интерес представляют работы по экспрессии данного гена в клетках центральной нервной системы млекопитающих. Этими исследованиями занимаются Джеф Личман и Джошуа Санес из Центра Мозга в Гарварде. Результатом их работы явилось создание трансгенных мышей с интегрированным геном GFP в клетки центральной нервной системы. Так как существуют различные цветовые вариации GFP, то возможно создание цветовых карт различных слоев коры мозга. Первая фотография такой карты появилась в журнале Nature 1 ноября 2007 года. Были составлены «мозговые радуги»участков коры мозжечка, гиппокампа, верхних холмиков четверохомия. Получены так же фотографии отдельных нейронов и их отростков, экспрессирующих ген GFP [2]. Индивидуально окрашенные нейроны помогут изучить не только структуру тех или иных участках коры, но и распределение проводящих путей в различных отделах центральной нервной системы. Однако исследования в этой области только начинаются. Основная задача, стоящая перед исследователями в настоящее время – привязать определенный цвет свечения к тем или иным типам нейронов.



Выводы

В дальнейшем данная методика позволит создавать трехмерные цветные карты тех или иных участков коры, что поможет как в изучении цитоархитектоники и миелоархитектоники различных участков коры и анатомии проводящих путей нервной системы, так и дегенеративных патологических изменений нервной системы, например, при болезни Альцгеймера.


Литература

1. Степаненко О.В., Верхуша В.В., Кузнецова И.М., Туроверов К.К. Флуоресцентные белки: физико-химические свойства и использование в клеточной биологии // Цитология. – 2007 – № 5. – С. 395-420.

2. Connecticut college chemistry department: GFP. URL: http://www.conncoll.edu/ccacad /zimmer /GFP-ww/GFP-1.htm.

3. Introduction to Fluorescent Proteins. URL: http://www.microscopyu.com/articles/livecellimaging /fpintro.html

4. Livet J, Weissman TA, Kang H et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system // Nature. - 2007. - 450. - P. 56-62.

5. Protein data bank. Green fluorescent protein. URL: http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId =1EMA.

6. Roger Y. Tsien The green fluorescent protein // Annu. Rev. Biochem. – 1998. – № 67. – P. 509–544.
green fluorescent protein gene

and investigations of Central Nervous system

Dudunia T.T.

Supervisors of studies – MD, senior lecturer Klykov A.I., MD, senior lecturer Frolova N.A.

Department of anatomy SGMA, department of medical microbiology SGMA

The Summary. This article is about future trends of green fluorescent protein and its gene using for revealing cells of central nervous system and nervous tracts. We used literary review to show the possibility of GFP using for labeling different cells and their processes. This method has got high aspects.



The Keywords: green fluorescent protein, gene, central nervous system


База данных защищена авторским правом ©bezogr.ru 2016
обратиться к администрации

    Главная страница