Фгбу «федеральный центр охраны здоровья животных»



Скачать 307.35 Kb.
страница1/3
Дата18.11.2016
Размер307.35 Kb.
  1   2   3



ФГБУ «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ОХРАНЫ ЗДОРОВЬЯ ЖИВОТНЫХ»


(ФГБУ «ВНИИЗЖ»)

Перевод № 7120



Автор(ы):

Carolina Cubillosa, Silvia Gómez-Sebastianb, Noelia Moreno и др.


Заглавие:

African swine fever virus serodiagnosis: A general review with a focus on the analyses of African serum samples


Перевод

заглавия:

Обзор по серодиагностике вируса африканской чумы свиней, в частности анализ образцов сыворотки из Африки.




Источник:




Статья из журнала:

Virus Research. – April 2013. – Vol. 173, Issue 1, P. 159–167.


Электронный ресурс:

URL: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168170212004108





Переводчик: Якупов М.Р.
Редактор: Фраймович Л.К.


ВЛАДИМИР

2014
РЕЗЮМЕ

Африканская чума свиней (АЧС) – инфекционная болезнь, которая вызывает высокую смертность у домашних свиней. В настоящее время нет вакцины против АЧС, и мероприятия по ликвидации этого заболевания в стране, где оно протекает эндемически, основаны только на компетентных программах диагностики и уничтожения инфицированных животных. Из-за наличия естественно аттенуированных штаммов условия течения инфекции могут привести к снижению смертности. В таких ситуациях заболевание можно диагностировать по наличию специфических антител. Использование классических и признанных диагностических методов, таких, как иммуноферментный анализ (ИФА), непрямой иммунофлюоресцентный анализ или иммуноблоттинг, позволило ликвидировать АЧС на Пиренейском полуострове в 1990-х годах. Однако при условии, что традиционные тесты включают использование антигенов, полученных из клеток, инфицированных вирусом АЧС, эти антигены имеют несколько недостатков, например трудность в достижении стандартизации, а также риски, связанные с манипуляцией живым вирусом. Такие недостатки привели к разработке альтернативных и более надежных систем производства антигенов для обнаружения антител к вирусу АЧС. В настоящем обзоре авторы приводят новые сведения об антигенах для серодиагностики АЧС, о значительных успехах, достигнутых в получении рекомбинантного антигена и об усовершенствовании методов серодиагностики АЧС. Более того, они описывают точность метода ИФА, разработанного для серодиагностики АЧС в Африке. Этот анализ основан на новом рекомбинантном белке p30r, полученном из восточноафриканского изолята вируса (штамм MORARA), который при секвенировании показал 100% сходство по аминокислотам с вирусным изолятом Georgia. В этой работе исследовали 587 полевых сывороток, отобранных от домашних свиней и бородавочников в Сенегале (Западная Африка), Демократической Республике Конго (Центральная Африка), Мозамбике (Юго-Восточная Африка) и в Южной Африке. Результаты показали, что ИФА на основе нового рекомбинантного белка р30r позволяет точно выявлять антитела против вируса АЧС, независимо от географического происхождения сывороток.



1. Введение

Классифицируемая Международным эпизоотическим бюро (МЭБ) как болезнь, подлежащая обязательной регистрации, африканская чума свиней (АЧС) – это высоко-контагиозное заболевание домашних и диких свиней, причиняющее большой экономический ущерб свиноводству в неблагополучных странах. Кроме того, в Африке, где болезнь протекает эндемически, в большинстве стран, южнее Сахары, АЧС также создает серьезную угрозу безопасности продуктов питания, ограничивая доступность важного источника белка для населения (Costard et al., 2009). Поскольку нет вакцины против АЧС, обнаружение специфических антител против вируса является показателем истории инфекции или текущей инфекции только в том случае, если наличие антител совпадает с наличием жизнеспособного вируса. Следовательно, быстрые методы серодиагностики могут способствовать полной ликвидации болезни в некоторых неблагополучных районах. Например, стратегия ликвидации АЧС на Пиренейском полуострове была основана на обнаружении и поголовном убое серопозитивных свиней. Эту стратегию нельзя рекомендовать для Африки, где страны не в состоянии компенсировать отбракованных свиней. Однако в этих районах ценные высокочувствительные и высокоспецифические серологические тесты должны улучшить понимание этой болезни, что позволит идентифицировать районы высокого риска, а также разработать соответствующие рекомендации по предупреждению болезни.

Вирус АЧС вызывает скрытые персистентные инфекции у естественных хозяев, а именно: у бородавочников (Phacochoerus africanus), кистеухих свиней (Potamochoerus porcus, P. larvatus) и мягких клещей (Ornithodoros moubata) (Anderson et al., 1998; Kleiboeker et al., 1999). У домашних свиней АЧС была первоначально описана как инфекция, вызывающая острую геморрагическую лихорадку, приводящую к гибели всех инфицированных животных. Однако слабовирулентные изоляты появились во время циркуляции вируса у домашних свиней, поэтому увеличилось превалирование подострых и скрытых инфекций (De Kock et al., 1940; Mebus and Dardiri, 1980; Bech-Nielsen et al., 1995; Penrith et al., 2004). Обычно у переболевших свиней развиваются антитела против вируса АЧС на 7-10 дни после инфекции, которые сохраняются в течение длительного времени. Следовательно, обнаружение специфических антител против вируса АЧС следует выполнять для диагностики подострой и скрытой форм болезни.

В связи с этим в настоящем обзоре придается особое значение современным сведениям о серологических тестах на АЧС и иммунодетерминантным антигенам, используемым в борьбе с заболеванием. Успехи, достигнутые в этих областях, могут существенно повлиять на разработку более надежных и точных серологических методов диагностики АЧС. Более того, авторы описывают точность ИФА, основанного на новом рекомбинантном белке р30r, полученном из вирусного изолята Восточной Африки (Мадагаскар) для серодиагностики АЧС в Африке и, возможно, в Европе. Образцы сыворотки от домашних и диких свиней, отобранные в Сенегале (Западная Африка), Демократической Республике Конго (Центральная Африка), Мозамбике (Юго-Восточная Африка) и в Южной Африке, были успешно проанализированы с помощью этого ИФА. Метод, основанный на новом рекомбинантном белке р30r, позволил точно определить антитела против вируса АЧС, независимо от географического происхождения сывороток. Это имеет особую значимость, если принять во внимание, что изоляты вируса АЧС из Европы и Западной Африки близкородственны друг другу (I генотип), в то время как изоляты из Южной и Восточной Африки более разнообразны (21 различный генотип).



2. Серодиагностика АЧС на основе белков

Знание белкового состава вирионных структур вируса АЧС играет важную роль, потому что некоторые белки имеют иммунологическую значимость. Кроме того, определение наиболее антигенных вирусных белков очень важно для усовершенствования серологических методов диагностики. Вирус АЧС является ДНК – содержащим единственным арбовирусом и единственным членом семейства Asfarviridae (Dixon et al., 2011). Вирус АЧС - это крупный вирус, который показывает тропизм к макрофагам и моноцитам, где он индуцирует около 100 полипептидов (Alcaraz et al., 1992). Около 40 таких молекул, как сообщают, включены в вирусную частицу (Carrascosa et al., 1985). Вирусная ДНК кодирует ряд новых генов, не присутствующих в других вирусных семействах. Способность вируса АЧС персистировать в организме переболевших естественных хозяев и домашних свиней, и возможность животных носить низковирулентные изоляты показывает, что вирус имеет эффективные механизмы ускользания от иммунных защитных систем (Dixon et al., 2004). Ядро вириона состоит из нуклеоида, заключенного в белковый слой (оболочку ядра), который содержит несколько вирусных белков (Andrés et al., 1997, 2002). Вокруг ядра находятся два липидных двойных слоя, называемых внутренней мембраной и наружной мембраной – капсидом. Дополнительно полная или разрушенная мембрана, полученная в результате бадинга вируса, может быть обнаружена в вирусной частице. Основным компонентом вирусного капсида является белок р72, один из первых вирусных белков, идентифицированный как ответственный за индукцию антител после естественной инфекции (Tabarés et al., 1980). Разработка процесса полуочистки этого белка от вирусных частиц впервые привела к использованию ИФА для скрининга антител, тем самым снизилось количество ложных положительных результатов, полученных с ранее разработанными антигенами (Tabares et al., 1981). Кроме того, эти два структурных белка р30 (также номинированный как р32) и р54 были точно идентифицированы как высокоантигенные во время инфекции (Pastor et al., 1989; Afonso et al., 1992; Alcaraz et al., 1990, 1995; Oviedo et al., 1997; Kollnberger et al., 2002; Gallardo et al., 2006). Более того, антитела против этих трех белков участвуют в нейтрализации вируса, препятствуют прикреплению (р72 и р54) и поглощению вируса клетками (р30) (Borca et al., 1994; Gómez-Puertas et al., 1996, 1998). Однако, несмотря на потенциал р72, р54 и р30 для серодиагностических целей, этих белков вируса АЧС недостаточно для опосредованной защиты антителами против различных штаммов вируса (Gómez-Puertas et al., 1998; Neilan et al., 2004).

Распознавание белков р54 и р30 вируса АЧС полевыми свиными сыворотками, собранными в Испании, сравнили с таковым полипротеина рр62 (продуцируемого геном СР530R) (Gallardo et al., 2006). Сыворотки от инфицированных свиней распознавали все три рекомбинантных белка (р54 r, р30r, рр62r) в иммуноблоттинге (ИБ). Антигенная реакционная способность этих трех белков была обнаружена, когда их использовали как антигены ИФА. Для достижения оптимальных сигналов в этой реакции необходимо растворить р54 в 7М мочевине. Это наблюдение свидетельствует, что антитела, индуцируемые против этого белка во время инфекции, распознают главным образом линейные эпитопы. Полипротеин рр62r – это белок-предшественник зрелых продуктов р35 и р15, то есть структурных белков, локализованных в оболочке ядра (Andrés et al., 2002). Неопубликованные данные из лаборатории авторов этой статьи идентифицируют р15 как зрелый белок, ответственный за антигенность рр62r.

Интересно с точки зрения серодиагностики АЧС распознавание рр62 сыворотками от свиней, инфицированных вирусом АЧС, продолжалось даже в плохо сохранившихся образцах, в то время как меньшая реактивность наблюдалась против р30 и р54 (Gallardo et al., 2006). Эти результаты, возможно, означают, что антитела против рр62 более стабильны или показывают более высокое родство, чем другие. Чтобы подтвердить эту гипотезу, необходимо поставить больше опытов с полевыми сыворотками. Это свойство рр62, возможно, очень полезно для того, чтобы преодолеть один из недостатков использования препаратов, не очищенных от инфицированных клеток, в качестве антигенов ИФА, а именно, отсутствие аналитической надежности для плохо сохранившихся образцов (Arias et al., 1993).

Обнаружение других новых серологических иммунодетерминант вируса АЧС было достигнуто путем скрининга вирусной библиотеки экспрессирующих последовательностей кДНК изолята вируса АЧС Ва71V при использовании иммунных антисывороток от инфицированных домашних свиней и от кустарниковых свиней (Kollnberger et al., 2002). В этом исследовании идентифицировали 14 вирусных открытых рамок считывания, кодирующих антигенные эпитопы вируса. Пять из них соответствуют следующим предварительно идентифицированным структурным белкам: р30 (CP204L), р54 (E183L) и р72 (B646L), бактериальному гистоноподобному белку (A104 R) и р10 (K78R). Кроме того, три неструктурных (F334L, K196R and NP419L) и четыре неустановленных белка (B602L, C44L, Cp312R and K205R) также показали значительную реактивность с иммунными антисыворотками. Выраженная реакция конвалесцентной свиной сыворотки была описана против белка, полученного путем трансляции открытой рамки считывания гена В602L in vitro (Irusta et al., 1996). В продольном анализе ответа антител против 12 упомянутых выше рекомбинантных белков при использовании сывороток от экспериментально зараженных свиней высокие и устойчивые титры антител были подтверждены против 4 из них: р54, K205R, A104R и B602L (Reis et al., 2007). Впоследствии антигенность этих рекомбинантных белков была также подтверждена при тестировании сыворотки от свиней, естественно инфицированных вирусом АЧС (Gallardo et al., 2009).

3. Традиционные процедуры производства антигена вируса АЧС и виды серологических анализов

Одним из самых первых серологических анализов, используемых для лабораторной диагностики АЧС, был иммуноэлектроосмофорез (ИЭОФ) (Pan et al., 1972). Этот анализ был гораздо более чувствительным, чем тест двойной диффузной преципитации на агаровом геле, и даже более чувствительным, чем реакция связывания комплемента (Ferris et al., 1980), вскоре он был принят в качестве скринингового теста. Обычный (традиционный) антиген, используемый в ИЭОФ, получали из экстрактов Vero клеток, инфицированных вирусом АЧС (Pan et al., 1974).

Тем не менее, при инфекционных заболеваниях, где диагностика основана на определении антител для подтверждения положительных реакций, обычно требуются подтверждающие тесты, особенно при использовании неочищенных антигенов. В связи с этим в прошлом в стратегии серодиагностики АЧС использовали ИЭОФ как скрининг-тест, а метод непрямой иммунофлюоресценции - для подтверждения положительных реакций (Botija, 1970; Pan et al., 1974). Этот подтверждающий тест проводят на культурах клеток, в которых только 10-20% клеток инфицированы вирусом. Следовательно, типичные положительные реакции можно рассматривать как флюоресцирующие внутриклеточные тельца, которые соответствуют наличию вируса. Положительные и ложные положительные реакции можно легко различить при анализе свиной сыворотки на инфицированных и не инфицированных клеточных культурах. Хотя эти методы сыграли решающую роль в серодиагностике и искоренении АЧС (Pan et al., 1974), они были трудоемки, и их было трудно применять при массовых исследованиях.

Поэтому ИЭОФ был вскоре заменен иммунным ферментным анализом (ИФА), считавшимся тогда самым чувствительным и подходящим методом для исследования большого количества сывороток. Это самый широко распространенный метод для диагностики подострой формы инфекции и скрытых вирусоносителей (Wardley et al., 1979; Tabares et al., 1981; Pastor et al., 1990). ИФА обладает более высокой чувствительностью, чем ИЭОФ, хотя в обоих тестах качество антигенного препарата влияет на конечную чувствительность и специфичность метода. Действительно, использование неочищенных антигенов в ИФА, например описанных для ИЭОФ, не обеспечивало достаточную специфичность, что не позволило считать его традиционным методом диагностики АЧС. Итак, Tabares и др. (1981) описали приготовление полуочищенного основного капсидного белка VP73 (р72) вируса АЧС, который значительно повышал надежность ИФА при использовании его в качестве антигена.

Впоследствии производство антигена для ИФА было усовершенствовано, чтобы сделать этот метод экономически приемлемым для крупномасштабных исследований. В настоящее время цитоплазматически растворимый антиген, используемый в этом тесте (Escribano et al., 1989), получают из MS клеток (клеточная линия почки обезьяны), выращенных в присутствии свиной сыворотки, инфицированной изолятом вируса АЧС, прошедшим 48 пассажей на клетках MS. Использование сывороток свиней в клеточных культурах вместо сывороток КРС предотвратило контаминацию антигена альбумином сыворотки КРС, что было главным фактором, ответственным за ложные положительные реакции в ИФА до тех пор (Escribano et al., 1989). Растворимую белковую фракцию инфицированных клеток готовят путем разрушения клеток, элиминации ядер и седиментации клеточных осколков на 20% - ной (вес\вес) сахарной подушке. Супернатант над слоем сахарозы используют в ИФА в качестве антигена. Этот неочищенный антиген в настоящее время рекомендуют в качестве обнаруживающего реактива для скрининга в международной торговле (OIE, 2012).

Несмотря на чувствительность ИФА, одним из недостатков продолжает оставаться число ложных положительных реакций на полевых сыворотках и стандартизация метода в лабораториях. Вследствие этих недостатков положительные образцы сыворотки требуется подтверждать вторым серологическим тестом. Хотя реакцию непрямой иммунофлюоресценции можно использовать для этой цели, ее заменили иммунноблоттингом (ИБ), который обладает повышенной специфичностью и чувствительностью, аналогичной чувствительности ИФА. Кроме того, было показано, что сыворотки теряли реактивность в ИФА раньше, чем в ИБ (распознавание линейных эпитопов вместо конформационных), что позволило усовершенствовать обнаружение антител в плохо сохранившихся сыворотках (Arias et al., 1993). Более того, ИБ представляет простую и объективную интерпретацию результатов (Pastor et al., 1989; Alcaraz et al., 1990; OIE, 2012). Эту реакцию ставят с таким же антигеном, как и в ИФА, и с антигеном, описанным выше. Антигенные белки растворяют в 17% - ном акриламидном геле и переносят на нитроцеллюлозный фильтр. Полоски, длиной примерно 4 см, содержащие белки 23 - 35 кДа, представляют собой антигенные полоски, используемые для отдельных образцов сыворотки. Этот тест имеет дополнительное преимущество в том, что фильтровальные полоски показывают стабильность на протяжении всего периода хранения и транспортировки при комнатной температуре в сухой атмосфере. Не наблюдается потери реактивности у перенесенных белков в течение 6 месяцев (Pastor et al., 1989). Другим подтверждающим тестом – альтернативой непрямой иммунофлюоресценции и ИБ является непрямой иммуно – пероксидазный метод окрашивания по бляшкам (IIPS) (Pan et al., 1982). Чувствительность и специфичность этого метода сравнима с таковой метода напрямой иммунофлюоресценции, но он более пригоден для крупномасштабных анализов.

Несмотря на удовлетворительное исполнение классических реакций, описанных здесь (на основе использования индуцируемых вирусом белков в инфицированных клетках в качестве антигенного реактива), у них есть несколько недостаков, например стандартизация методов и необходимость манипулировать инфекционным возбудителем; при этом обязательно строгое соблюдение правил биобезопасности для патогенов 3 и 4 группы (OIE, 2012).

4. Серологические тесты с использованием рекомбинантных белков для диагностики АЧС

Достижения молекулярной биологии позволили значительно улучшить возможности селекции и производства иммунореагентов и их применения для разработки новых методов. В этом отношении в последние годы научные исследования были направлены на разработку рекомбинантных антигенов, предназначенных для серологических диагностических исследований АЧС.

Использование рекомбинантных белков как реагентов имеет много преимуществ по сравнению с антигенами, приготовленными на основе инфицированных вирусом клеток. В случае с вирусом АЧС использование рекомбинантных белков исключает необходимость манипулировать потенциально опасным живым вирусом и позволяет стандартизировать и повысить производство белков. Кроме того, эти антигены улучшают однородность результатов, получаемых в лабораториях, и могут повысить чувствительность и специфичность, снизить таким образом ложные положительные реакции, продуцируемые веществами клеточной культуры, которые контаминируют антигены (Escribano et al., 1989). В некоторых случаях, например в ИБ, рекомбинантные антигены также облегчают интерпретацию результатов диагностики (Alcaraz et al., 1995).

Рисунок 1. Анализ последовательностей рекомбинантного белка р30 изолятов Morara/Georgia и E70 вируса АЧС. (А) Выравнивание последовательностей р30, полученных из двух изолятов вируса АЧС. Остатки, в которых они отличались, указаны стрелкой. Количество остатков также указывается в скобках. (В) Корреляция между антигенностью, структурой и изменчивостью в белках р30 двух изолятов вируса АЧС. Графики показывают изменения антигенного индекса в зависимости от положения аминокислоты для испанского Е75 и африканского изолятов MALAGASY. Горизонтальные черные полосы указывают регионы прогнозируемого внутреннего расхождения.

Было описано много потенциально полезных вирусных белков (кандидатов для диагностики), однако лишь небольшое число было проверено и утверждено для различных методик. Одним из первых рекомбинантных анализов, описанных для вируса АЧС, был вестерн-блоттинг, подтверждающий положительные результаты, полученные при обнаружении антител к вирусу АЧС в ИФА (Alcaraz et al., 1995). Этот подтверждающий тест был основан на использовании белка р54, экспрессированного в Escherichia coli и соединенного с N концом MS2 полимеразы. Рекомбинантный вариант вестерн-блоттинга был высоко специфичен и в равной степени чувствителен для обнаружения свиней с антителами к вирусу АЧС, как и традиционный вестерн-блоттинг с использованием неочищенных антигенов, полученных из описанных выше инфицированных клеток.

Такая прокариотная экспрессия Е. coli была использована Reis и др. 2007 для получения 12 вирусных белков, ранее идентифицированных как серологические мишени (Kollnberger et al., 2002). Образцы сывороток от свиней, экспериментально инфицированных слабопатогенным изолятом вируса АЧС, взятые в различные дни после инфицирования, были проанализированы в ИФА с использованием этих 12 рекомбинантных белков отдельно. Напряженный иммунный ответ был установлен на 4 из них (p54, гистоноподобный, pK205R и pB602L). Все они показали 100% чувствительность на 21-й день после инфицирования. Интересно заметить, в этом исследовании установили, что рекомбинантный белок р73, экспрессированный в бактериях, не является адекватной серологической мишенью для серодиагностики вируса АЧС, так как он не смог выявить серологически положительных свиней со скрытыми симптомами.

Пригодность этих 4 белков, кандидатов для диагностики, была в дальнейшем оценена на европейских и африканских полевых сыворотках свиней (Gallardo et al., 2009). ИФА на основе очищенных рекомбинантных белков, полученных из Е. coli, оказался эффективным для анализа свиных сывороток из Европы при использовании р54 и pB602L в качестве антигенов, чувствительность и специфичность составляли 95 и 98% соответственно. Следовательно, эти ИФА на основе рекомбинантных белков ставили так же, как и диагностический метод, одобренный МЭБ (традиционный ИФА + подтверждение вестерн-блоттингом).

Серологическая дифференциация полевых изолятов вируса АЧС невозможна из-за отсутствия различных серотипов. Однако вариабельность последовательностей, наблюдавшаяся среди вирусных изолятов различного географического происхождения, может повлиять на распознавание специфических антигенов в серологических тестах. Точный отбор антигенов вируса АЧС с низким уровнем антигенной вариабельности среди вирусных изолятов есть предпосылка для использования их в серологических реакциях. Несмотря на то, что ограниченное число положительных сывороток из Западной Африки было исследовано, 9 положительных образцов, идентифицированных рекомендуемыми МЭБ тестами в этом опыте, были подтверждены в ИФА на основе рекомбинантных белков р54 и pB602L. При условии их выполнения, эти методы на основе рекомбинантных белков можно также применять для тестирования образцов сывороток из Западной Африки. Что касается сывороток из Восточной Африки, поскольку очень мало АЧС-положительных образцов было проанализировано в этих ИФА на основе рекомбинантных белков, чувствительность данного теста не подсчитывали (Gallardo et al., 2009). Однако частота обнаружения положительных сывороток в этих реакциях была ниже, чем в рекомендуемых МЭБ тестах. Этот вывод, возможно, говорит о том, что эти ИФА на основе рекомбинантных белков показывают неприемлемую чувствительность при диагностике образцов из Восточной Африки.

В дополнение к анализам образцов сыворотки свиней, исследование сывороток, отобранных от диких животных, например бородавочников (Phacochoerus africanus), представляет особый интерес для Восточной и Южной Африки, где дикие животные являются резервуаром вируса АЧС. Следовательно, борьба с этим заболеванием у бородавочников весьма релевантна для контроля за спорадическими вспышками у домашних свиней, побывавших в контакте с этими дикими животными, и для определения статуса заражения бородавочников вирусом АЧС, где лесной цикл играет решающею роль в эпидемиологии болезни (Lubisi et al., 2005; Jori and Bastos, 2009). Небольшое количество образцов от бородавочников, собранных в Уганде, было исследовано в ИФА на основе рекомбинантных белков с использованием белков, экспрессированных в Е. coli. Всего 23 из 26 положительных сывороток, идентифицированных в рекомендуемых МЭБ тестах, были также положительными в ИФА на основе рекомбинантных белков В602L и р54 (Gallardo et al., 2006). Эти результаты противоречат низкой чувствительности, установленной при тестировании сывороток от домашних свиней из Восточной Африки. Это расхождение, возможно, связано с отдельными генотипами вируса АЧС, ответственными за выработку антител. Изоляты вируса АЧС, относящиеся к IX генотипу, были зарегистрированы в Уганде (Gallardo et al., 2009), тогда как главным образом II генотип зарегистрирован в Мозамбике во время вспышек 1998 - 2005 гг. (Bastos et al., 2004; Lubisi et al., 2005). Следовательно, если бы эту гипотезу подтвердили, то результаты ИФА на основе рекомбинантных белков говорили бы о том, что антигенность белков В602 L и р54 консервативна в изолятах вируса АЧС с IX генотипом, но не в изолятах с генотипом II.

Эукариотные системы, например рекомбинантная система бакуловируса и клеток насекомых, обеспечивает альтернативную систему для производства рекомбинантных антигенов. Преимущество этой системы экспрессии по сравнению с Е. coli состоит в том, что белки, вероятно, должны продуцироваться в нативной конформации, так как они могут после трансляции модифицировать белки, которые экспрессируются эффективно. Белки вируса АЧС р30, р54 (Oviedo et al., 1997; Gallardo et al., 2006) и полипротеин рр62 (Gallardo et al., 2006) были получены как рекомбинантные антигены, экспрессированные в клетках насекомых (Sf9 или Hi5 клетки) с использованием системы экспрессии бакуловируса. Эти рекомбинантные белки были использованы в ИФА и вестерн-блоттинге для обнаружения антител к вирусу АЧС в сыворотках от экспериментально зараженных свиней и в полевых сыворотках от европейских серологически положительных животных со скрытой инфекцией. Эти анализы показали, что ИФА на основе рекомбинантных белков р30, р54 и рр62 с использованием белков, экспрессированных в системе бакуловирусов, были высоко эффективны для серодиагностики АЧС, чувствительность и специфичность составляли 96-99%. Более того, в соответствии с результатами, полученными с использованием белков р54 и рВ602L, экспрессированных в Е. coli (Gallardo et al., 2009), ИФА с использованием рекомбинантных белков р30, р54 и рр62, экспрессированных системой бакуловируса, показали более высокую чувствительность по сравнению с традиционной рекомендуемой МЭБ ИФА (на основе клеточных экстрактов инфицированных клеток) для анализа плохо сохранившихся образцов (Gallardo et al., 2006). Следовательно, использование этих экспрессированных в системе бакуловируса белков в качестве реагентов в ИФА снижает количество ложных положительных реакций, что обеспечивает более точную диагностику.

Использование насекомых в качестве живых биофабрик – рентабельная альтернатива производству белка в клетках насекомых в системе бакуловируса (Barderas et al., 2000; Pérez-Filgueira et al., 2007). Это весьма релевантно для развивающихся стран. Производство гетерологичных белков с помощью комбинаций систем рекомбинантного бакуловируса и личинок насекомых Trichoplusia ni (T. ni) было признано усовершенствованной технологией системы экспрессии бакуловирусов (IBES®technology), что является одной из лучших производственных альтернатив на основе векторов бакуловируса. Эту недорогую платформу использовали для эффективного получения нескольких рекомбинантных антигенов в качестве диагностических реагентов для других заболеваний (Gomez-Sebastian et al., 2008; Pérez- Martín et al., 2008; Encinas et al., 2011; Todolí et al., 2009). Более того, рекомбинантный белок р30 для АЧС очень высокого качества был получен по технологии IBES®technology (Barderas et al., 2000; Pérez-Filgueira et al., 2006). Методы ИФА и иммуноблоттинг были утверждены с использованием экстрактов насекомых, содержащих рекомбинантный белок р30 без дальнейшей очистки. Рекомбинантный белок р30, полученный с помощью насекомых, показал очень низкий уровень фоновой реактивности при использовании в качестве реактива в ИФА, что позволяет провести точные различия между положительными и отрицательными сыворотками и снизить количество ложных положительных реакций (Pérez-Filgueira et al., 2006). Эти результаты контрастируют с результатами, полученными при использовании рекомбинантного белка р30, экспрессированного в E. сoli, который создавал очень высокую фоновую реактивность даже при использовании белка высокой степени очистки (Reis et al., 2007). Процессы очистки значительно повышают стоимость производства любого белка и приводят к большой потере выхода рекомбинантного белка. От одной инфицированной личинки насекомого можно получить достаточное количество реагента рекомбинантного белка р30 для выполнения более 40 000 исследований в ИФА и 2 000 подтверждений в иммуноблоттинге (Pérez-Filgueira et al., 2006).

ИФА на основе рекомбинантного белка р30, полученного в личинках трихоплюсии, была утверждена тестированием полевых сывороток от больных АЧС свиней из Испании. Этот анализ показал чувствительность 98.2 %; эта величина аналогична таковой традиционного ИФА, рекомендованного МЭБ (Escribano et al., 1989). Однако специфичность такого рекомбинантного белка была значительно лучше по сравнению с традиционным ИФА (97,4 % против 87,8 %).


  1   2   3


База данных защищена авторским правом ©bezogr.ru 2016
обратиться к администрации

    Главная страница