Федеральное государственное бюджетное



страница9/18
Дата04.05.2016
Размер1.6 Mb.
1   ...   5   6   7   8   9   10   11   12   ...   18

2.6. Определение нуклеотидной последовательности


Прямое определение двухцепочечных продуктов амплификации проводилось на автоматическом секвенаторе модели 373А фирмы «Applied Biosystem Inc.» с набором реактивов «Thermo Sequenase II dye terminator cycle sequencing kit» фирмы «Amersham pharmacia biotech», а так же на автоматическом секвенаторе CEQ 8800 (Beckman Coulter Inc.) с набором реактивов «Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit» фирмы «Beckman Coulter», при помощи тех же праймеров (L1490, H2198).

Параметры терминирующей реакции секвенирующего ПЦР были следующими: денатурация – 15 секунд при 94ºС, эффективная гибридизация и элонгация имели одинаковую температуру - 60º и длились, в целом, 4 минуты. Всего выполнялось 30 циклов амплификации. Необходимо отметить, что температура отжига как при накопительном ПЦР, так и при секвенирующем значительно отличалась от расчетной, составляющей 54-55ºС [340]. В первом случае она была ниже и составляла 46ºС, а во втором значительно выше и составляла 60ºС.



    1. 2.7. Оценка генетического разнообразия популяций


Биологическое разнообразие можно разделить на три основных уровня: 1) биоразнообразие в отношении генов (внутрипопуляционное или генетическое разнообразие), 2) разнообразие видов и 3) разнообразие экосистем. «Генетическое разнообразие» относится к вариации генов внутри видов, что является смешением генов, содержащихся в особях. Это охватывает различные популяции одного и того же вида или генетическую вариацию внутри популяции. Генетические различия можно обнаружить между особями внутри популяции, и также различия можно выявить в аллельных частотах между популяциями. Во всех относительное число вариации зависит от вида, его истории и окружающей среды. Наличие вариантов (полиморфизма) в образце может быть оценено по его генотипам, аллелям, гаплотипам или нуклеотидам. Образцы могут быть иерархически разделены на уровне вида, популяции или внутри популяции. На молекулярном уровне полиморфизм определяется сосуществованием альтернативных связующих конфигураций или вариантов ДНК при их определении данным методом обнаружения.

Как известно, аллель – это альтернативная форма гена. Если ген соответствует специфичной последовательности нуклеотидов по всей молекуле ДНК, то эти аллели представляют собой разные последовательности нуклеотидов, которые возможны для этого отдельного локуса. Различия в аллелях в единичном локусе в популяции указывают на генетическую изменчивость. Генетическую изменчивость определяют количественно для разных генов и для разных особей или популяций.

Генетическое разнообразие формируют следующие факторы – мутация, миграция, рекомбинация, отбор, дрейф. Отбор влияет на фонд настоящей генетической изменчивости и, соответственно, способствует эволюционному процессу. Генетическое разнообразие позволяет популяциям адаптироваться к изменяющимся условиям окружающей среды.

В популяционной генетике особое внимание уделяется местной единице интербридинга/аутбридинга более большой популяции потому, что изменения в частотах аллелей возникают внутри таких ограниченных единиц и могут привести к эволюции адаптивных признаков. Эти местные единицы интербридинга обычно называются «местные популяции», «субпопуляции» или просто «популяции». Размер популяции не является безгранично большим и не остается постоянным. Генетические связи между популяциями могут различаться в зависимости от степени имеющего место потока генов.

Система естественного скрещивания особей может быть изучена путем исследования частот, с которыми альтернативные генотипы возникают в популяции. Когда особи в популяции подвергаются скрещиванию, которое произвольно относится к исследуемым аллелям, могут ожидаться определенные характеры частот генотипа. Система спаривания или скрещивания имеет значительное влияние на частоту возникновения альтернативных генотипов в данной популяции.

Эффективный размер популяции (Ne) – число родителей, ответственных за генетический состав следующего поколения. Таким образом, Ne меньше, чем фактическое число особей в популяции. Для оценки эффективной численности по данным о генетическом полиморфизме популяции может быть использован эффективный размер популяции (Ne), который отражает только численность размножающихся особей и может быть выведен из генетических данных через параметр тета (θ = 4Neµ; где µ - скорость мутирования, выраженная в нуклеотидах на поколение). θ = 2Neλ (для гаплоидных генов – СО1), θ = 4Neλ (для диплоидных генов – микроспоридии).

Основной анализ генетического разнообразия складывается из: 1) описания изменчивости внутри и между популяциями и пр., 2) оценки взаимосвязей между особями, популяциями и пр., которая включает в себя вычисление расстояний (геометрическое и генетическое) между парой исследуемых объектов и 3) экспрессии взаимосвязей между результатами, полученными от разных наборов признаков.

Качественное измерение генетического разнообразия: измерение генетического разнообразия внутри популяции. На основе ряда вариантов:



  • Полиморфизм или уровень полиморфизма (Pj)

  • Долю полиморфных локусов

  • Богатство аллельных вариантов (А)

  • Среднее количество аллелей на локус.

На основе частоты вариантов:

  • Эффективное число аллелей (Ae)

  • Средняя предполагаемая гетерозиготность (He; генетическое разнообразие Нея (Nei)).

Количественное измерение генетического разнообразия: измерение генетического разнообразия между популяциями:

  • Межпопуляционная дифференциация (различия между популяциями на разных уровнях структуры) для одного локуса (gst)

  • Межпопуляционная дифференциация для нескольких локусов (Gst)

  • Вклад популяции в общее генетическое разнообразие

  • F-статистика (Wright)

  • Анализ молекулярной вариансы (AMB) (Analysis of molecular variance (AMOVA)) внутри вида.

Количественное измерение генетических взаимосвязей: разнообразие и дифференциация на нуклеотидном уровне:

  • Используя данные последовательности: 1) внутрипопуляционное и 2) межпопуляционное разнообразие нуклеотида.

  • Используя данные рестрикции.

В данном случае каждый нуклеотид – локус.

1   ...   5   6   7   8   9   10   11   12   ...   18


База данных защищена авторским правом ©bezogr.ru 2016
обратиться к администрации

    Главная страница