Федеральное государственное бюджетное



страница10/18
Дата04.05.2016
Размер1.6 Mb.
1   ...   6   7   8   9   10   11   12   13   ...   18

2.8. Филогенетический анализ


Первичную обработку расшифрованных последовательностей производили с помощью программы Bio Edit [221, 222]. Для анализа филогеографической (или геногеографической по Серебровскому (1928)) структуры видов использовалась программа TCS, версия 1.2.1 [156]. «Критерий экономности», или максимальной экономии (Maximum Parsimony, MP) [378] использовался для оценки минимального числа мутаций, которые разделяют гаплотипы внутри одной и той же сети. Анализ популяционной структуры, генетической изменчивости образцов, расчет индексов FST, AMOVA и популяционных параметров производили с помощью программы ARLEQUIN v3.5.1.3. [194, 349]. Также использовали программу DnaSP v5 [267], чтобы вычислить частоты попарных различий между гаплотипами (mismatch distribution) и получить распределения попарных генетических расстояний для оценки гипотезы недавнего роста популяции.

Для реконструкции демографической истории популяций методами Байсовского скайплота использовался пакет программ BEAST 1.7.4. [168]. Модель нуклеотидных замен для каждого набора данных была выбрана с использованием программы jMODELTEST версии 1.0 [218, 316], на основании информационного критерия Акаике [108].

Независимая калибровка «молекулярных часов» для Gmelinoides fasciatus по фрагменту гена СО1 митохондриальной ДНК проведена в программе IMa version 2.0 [228, 254]. Для перевода масштаба времени демографических историй для G. fasciatus из замен на сайт в годы вследствие отсутствия калибровки молекулярных часов для амфипод на момент проведения анализа было использовано среднее значение скоростей дивергенции (1,6% на млн. лет), предложенных для членистоногих [321]. После того, как абсолютные временные масштабы были вычислены, демографические истории были сопоставлены с палеоклиматической летописью, временные оценки для которой были произведены по калибровкам радиоуглерода осадочных кернов [24, 216, 319, 390].

Программа MrBayes v. 3.2.1 [333] использована для построения древа микроспоридий.

MIGRATE-N оценивает эффективный размер популяции и скорость миграции между популяциями с использованием модели матрицы миграций, которая включает скорости ассиметричной миграции и размеры различных субпопуляций [124]. Параметры оцениваются с использованием методов максимального правдоподобия или байесовского метода. Можно проанализировать следующие виды входных данных: нуклеотидные последовательности, данные по единичному нуклеотидному полиморфизму, микросателлитные и электрофоретические данные. Помимо вычисления размера популяции и степени миграции, выходные файлы включают значения функций правдоподобия, процентили, тесты на соотношения правдоподобия.

Различия в составе сообществ микроспоридий между популяциями хозяина G. fasciatus оценивали вычислением дистанций Хеллингера (Hellinger distances) с использованием библиотеки vegan на языке R [304].



Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ




    1. 3.1. Популяционная структура G. fasciatus озера Байкал


Определение нуклеотидных последовательностей

Исследование генетической изоляции амфипод G. fasciatus, населяющих различные участки побережья Байкала, проведено с использованием генетического маркера – фрагмента гена СО1 (первой субъединицы цитохром-с-оксидазы) митохондриальной ДНК. В этом фрагменте, несмотря на его консервативность, количество синонимичных замен обычно достаточно для проведения исследований на межвидовом и даже на популяционном уровне [198]. В нашем случае, нуклеотидное разнообразие Pi для юго-западной популяции существенно меньше нуклеотидного разнообразия остальных популяций (табл. 3), что может свидетельствовать об отборе, «бутылочном горлышке» или каком-то другом серьезном «стрессе», действующем на эту популяцию.

Скорость накопления нуклеотидных замен в этом гене для гастропод составляет 1.83% на млн. лет [412], среднее значение скоростей дивергенции для членистоногих – 1.6% на млн. лет [321]. Последнее значение и использовано в качестве начального в настоящем исследовании.

Примененные нами маркеры хорошо зарекомендовали себя как информативные и успешно использовались в серии предыдущих эволюционных исследований, среди которых были работы по молекулярно-филогенетическим исследованиям амфипод [289].



В ходе исследования нуклеотидные последовательности фрагмента митохондриального гена СО1 длиной 565 пар нуклеотидов (п.н.) определены для 108 представителей G. fasciatus, собранных в 38 точках озера Байкал, а также в районе Иркутской и Усть-Илимской ГЭС на р. Ангара, в Финском заливе в районе пос. Ольгино, Усть-Луга (Ленинградская область) и в оз. Арахлей (Читинская область) (табл. 2). Последовательности депонированы в GenBank с номерами доступа FJ715823 – FJ715919.

Таблица 2. Сводная таблица, дающая информацию о количестве расшифрованных последовательностей из каждой конкретной точки сбора

п/п

Место сбора

Количество последовательностей

СО1

рДНК

Исследовано рДНК всего

1

Пос. Усть-Луга, Ленинградская область

1

-

-

2

Пос. Ольгино, Ленинградская область

1

-

-

3

Озеро Арахлей, Читинская область

3

-

-

4

Р. Ангара, Усть-Илимская ГЭС

7

-

9

5

Р. Ангара, 60 км от истока

7

3

5

6

Пос. Култук

7

-

35

7

М. Половинный

18

6

31

8

Пос. Листвянка

7

-

5

9

Бухта Сенная

-

8

19

10

Бухта Песчаная

4

3

4

11

Пос. Бугульдейка

3

-

2

12

Мыс Шаманский, 200 м на восток

3

-

3

13

Бухта Абетулиха

-

-

2

14

Устье р. Утулик

3

-

46

15

Муринская банка

3

-

2

16

Пос. Танхой

2

-

-

17

Р. Переемная, пос. Мишиха

-

1

7

18

М. Коврижка, пос. Мишиха

-

2

5

19

Пос. Мантуриха

-

-

23

20

О-ва Боярские

-

-

4

21

Посольский сор

1

-

27

22

Устье р. Селенга, м. Средний

-

-

8

23

Залив Провал

3

1

2

24

Оз. Слюдянское

-

-

2

25

Губа Таланка

3

-

-

26

Пролив Ольхонские ворота, бухта Саган-Хэр

2

2

6

27

Пролив Ольхонские ворота, бухта Загли

-

7

12

28

Залив Малое море, м. Бурхан

-

3

5

29

Залив Малое море, м. Зундук

3

-

2

30

Бухта Гремячинск

2

1

3

31

Бухта Безымянная

1

-

-

32

Пос. Максимиха

2

-

-

33

Устье р. Чивыркуй

3

1

2

34

Полуостров Святой Нос, мыс Верхнее Изголовье

3

-

-


35

Бухта Заворотная

2

1

4

36

Губа Большая Коса

2

-

-

37

Губа Богучанская

2

-

1

38

Устье р. Кичера

2

3

5

39

Р. Малая Черемшаная, 1 км южнее

-

-

2

40

Губа Якшакан

3

-

1

41

Губа Иринда

-

4

7

42

Губа Дагарская

2

4

6

43

О. Ярки

3

2

4


Таблица 3. Число полиморфных сайтов и нуклеотидное разнообразие популяций G. fasciatus (DNAsp)

Популяции

S

Pi

центральная

22

0,014

северная

21

0,009

юго-восточная

22

0,008

юго-западная (104 последовательности)

15

0,004

общие значения

80

0,041


Исследование популяционной структуры G. fasciatus озера Байкал, р. Ангара и некоторых внебайкальских представителей

Впервые дана молекулярно-филогенетическая характеристика (рис. 8, 9), выявлен внутривидовой полиморфизм байкальской амфиподы G. fasciatus по результатам анализа последовательностей фрагментов гена первой субъединицы цитохром оксидазы С 108 индивидуумов, отловленных в 38 точках озера Байкал и 5 точках за его пределами (табл. 1). Исследование пространственной генетической структуры проводили с помощью простирающегося древа, построенного по фрагменту гена СО1 мтДНК методом максимальной экономии (Maximum Parsimony, MP).

Для оценки филогении методом максимальной экономии используются последовательности нуклеиновых кислот. Данный метод позволяет использовать полные IUB неоднозначные коды и оценивать предковые нуклеотидные состояния. В данном методе можно также учитывать только трансверсии, множественное ветвление (политомию), восстановить предковые состояния, использовать 0/1 веса признаков и вычислить длины ветвей. Данный метод адекватен для наших данных, т.е. не обнаружено статистически достоверных отклонений от предположений, что 1) нет отбора,



Рис. 8. Древо, построенное методом максимальной экономии с помощью программы TCS 1.2.1 на основе 108 последовательностей фрагмента митохондриального гена СО1.

Цветом выделены разные клады, соответствующие юго-западной (выделено желтым цветом), северной (красным), центральной (синим) и юго-восточной популяции (выделено зеленым цветом). Площадь пропорциональна числу наблюдающихся гаплотипов.

Сокращения: Ang – р. Ангара, Pes – б. Песчаная, Bug – пос. Бугульдейка, UI – г. Усть-Илимск, Zun – м. Зундук, Pol – м. Половинный, Sag – б. Саган-Хэр; Pro – з. Провал, UsL – пос. Усть-Луга, Sha – м. Шаманский, Kul – пос. Култук, Tan – пос. Танхой, Tal – г. Таланка, Mur – Муринская банка, PoS – Посольский сор, гаплотип 779 Kul включает также гаплотипы из пос. Ольгино и оз. Арахлей; Gre – б. Гремячинск, Dag – г. Дагарская, Mak – пос. Максимиха, Bez – б. Безымянная; Chi – р. Чивыркуй, Yar – о. Ярки, Yac – б. Якшакан, Zav – б. Заворотная, Bko – г. Большая Коса, Bog – г. Богучанская, Kic – р. Кичера.



Рис. 9. Карта-схема популяций G. fasciatus на Байкале.

Цветом выделены популяции: юго-западная (выделено желтым цветом), северная (красным), центральная (синим) и юго-восточная (выделено зеленым цветом).


то есть все замены являются нейтральными и 2) все полиморфные положения последовательности эволюционируют независимо (являются независимыми признаками).

Простирающееся древо характеризует степень сходства, однако в отличие от филогенетического не несет информации о последовательности событий во времени. Современные особи могут находиться как в узлах, так и на концах ветвей, то есть предок и потомок могут сосуществовать в отличие от древа при филогенетическом (или кладистическом) анализе.

Построенное в ходе нашего исследовании древо (рис. 8) дало нам представление о степени репродуктивной изоляции между особями, обитающими в обозначенных районах. Таким образом, можно выделить четыре группы G. fasciatus, которые образуют четыре отдельные ветви на простирающемся древе, и считать их отдельными популяциями. Группы на древе соответствуют четырем непрерывным большим географическим ареалам, обозначенным на рисунках 8 и 9. По западному берегу озера от бухты Половинка до пролива Малое Море обитает юго-западная популяция G. fasciatus, ареал юго-восточной популяции простирается от пос. Култук до губ. Таланка, на среднем Байкале по восточному берегу от губы Таланка до Чивыркуйского залива встречается центральная популяция бокоплава. Популяционная принадлежность образцов сбора в губе Таланка остается под вопросом. На всем протяжении северного Байкала, как по западному, так и по восточному берегу обитает северная популяция G. fasciatus. Все популяции непрерывны с географической точки зрения. Границы между этими ареалами определены с точностью расстояния между станциями сбора. Сложно картировать их более точно, так как не ясно, чем определяется ширина границ: 1) прерывистое распределение вдоль берега; 2) жизнеспособность гибридов первого поколения.

Для того чтобы оценить, отражает ли построенное нами древо популяционную структуру G. fasciatus, мы провели тест на дифференцированность установленных групп (уровень достоверности = 0.05) Arlequin. Тест показал достоверные различия между всеми парами групп. Для более подробного исследования генетической подразделенности вида, мы вычислили индексы фиксации FST (статистика для аллелей) и ФST (форма нуклеотидного разнообразия) [406, 407], чтобы установить, существует ли обмен генетической информацией между особями из разных групп, и если да, то какова его интенсивность. Другими словами, скрещиваются ли особи из разных групп с появлением жизнеспособного потомства. Эти индексы фиксации отражают соотношение внутри- и межгруппового полиморфизма. Стоит отметить, что при вычислении индекса FST одинаковыми считаются гаплотипы, абсолютно идентичные по последовательностям нуклеотидов. Из этого следует, что он дает несколько завышенные значения.


Таблица 4. Популяционные попарные генетические дистанции (FST)


Популяции

центральная

северная

юго-восточная

юго-западная

центральная

0.00










северная

0.73

0.00







юго-восточная

0.74

0.79

0.00




юго-западная

0.91

0.92

0.92

0.00



Таблица 5. Степень нуклеотидного разнообразия среди популяций (ФST) [193, 300]

Популяции

центральная

северная

юго-восточная

юго-западная

центральная

0,00










северная

0,67

0,00







юго-восточная

0,69

0,75

0,00




юго-западная

0,75

0,81

0,83

0,00

Индексы как FST, так и ФST для нашего набора последовательностей оказались очень высокими (табл. 3), что свидетельствует о низком уровне обмена генами между установленными группами. То есть, несмотря на то, что ареалы обитания не изолированы, и особи G. fasciatus из разных клад (учитывая их высокую миграционную активность [38]) могут скрещиваться между собой, потомство от таких скрещиваний скорее всего слабо- либо нежизнеспособно. В противном случае показатели внутри- и межпопуляционной изменчивости были бы в меньшей степени различными.

Проведенный анализ подтвердил существование нескольких отдельных популяций G. fasciatus в Байкале.
Определение уровня достаточности выборки

В дополнение провели тест на репрезентативность выборки для каждой отдельной популяции исследуемого вида, основанный на бутстреп-анализе (неопубликованные данные: Букин Ю.С. с соавторами). При этом производится выбор случайных последовательностей из набора данных и расчет параметра θ в 1000 повторностях. На основе полученных данных вычисляется среднее значение θ и среднеквадратичное отклонение. Ошибка среднего значения должна лежать в пределах 5% (т.е. 95% доверительный интервал). В таком случае выборка для той или иной популяции считается репрезентативной.

В нашем случае только центральная популяция выпадает из этого интервала, что требует увеличения размера выборки. При дальнейшем исследовании центральной популяции, результаты для нее могут быть не достоверными, интерпретировать их следует с осторожностью.

1   ...   6   7   8   9   10   11   12   13   ...   18


База данных защищена авторским правом ©bezogr.ru 2016
обратиться к администрации

    Главная страница