Фармакогностическое изучение лекарственных растений с использованием молекулярно-биологических методов 15. 00. 02- фармацевтическая химия, фармакогнозия



страница1/5
Дата02.05.2016
Размер0.49 Mb.
  1   2   3   4   5

На правах рукописи

Баева Вера Михайловна


ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ

ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ С

ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОЛЕКУЛЯРНО-

-БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

15.00.02- фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат


диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук

Москва - 2009

Диссертационная работа выполнена в ГОУ ВПО Московская медицинская академия

имени И.М. Сеченова Росздрава и в НИИ физизико-химической биологии им. А.Н. Бело-зерского МГУ им. М.В.Ломоносова
Научные консультанты:

член-корр. РАМН, доктор фармацевтических наук

профессор Ирина Александровна Самылина

академик РАЕН, доктор биологических наук

профессор Андрей Сергеевич Антонов

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук,

профессор Сокольская Татьяна Александровна

доктор фармацевтических наук Баландина Ирина Анатольевна

доктор фармацевтических наук,

профессор Патудин Александр Васильевич


Ведущая организация: ГОУ ВПО Ярославская Государственная

медицинская академия

Защита состоится « «___________2009 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.09. при Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова

(г. Москва, Никитский бульвар, 13).


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (117998, г. Москва, Нахимовский пр., д. 49).
Автореферат разослан « » 2009г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д.208.040.09.

доктор фармацевтических наук, Наталья Петровна Садчикова

профессор

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Перспективность исследований лекарственных растений народной медицины несомненна для современной отечественной фар-мации. При введении таких растений в медицинскую практику в первую оче-редь следует проводить целый комплекс исследований, устанавливающих их видовую принадлежность и очерченностъ границ вида.

Во многих родах, в том числе и лекарственных растений с богатым видовым составом,отмечено такое широко распространенное явление, как полиморфизм, который затрудняет видовую идентификацию растений при осуществлении за-готовки лекарственного растительного сырья и создает необходимость опреде-ления глубины этой изменчивости на уровне генома растения.

Многие лекарственные растения обладают аберратными формами размноже-ния (например, апомиксисом) или склонны к образованию межвидовых гибри-дов. Эти проблемы характерны для большого числа лекарственных растений семейств: розоцветные, бобовые, гречишные, кипрейные, сложноцветные и др. Некоторые виды из этих семейств применяются в научной медицине, а такие как представители рода манжетка, язвенник, ястребинка, кипрей и многие дру-гие являются перспективными для отечественной научной медицины. Разработка оптимальных методик изучения лекарственных растений будет спо-собствовать сохранению ценных сырьевых ресурсов (В.В.Алёхин, 1938).

В связи с этим вопросы совершенствования определения равноценности ви-дов при изучении лекарственных растений с использованием новейших дости-жений науки обоснованы и своевременны. Актуально введение в практику оте-чественного здравоохранения новых видов лекарственного растительного сы-рья и расширение ассортимента препаратов обладающих противовоспалитель-ным, противоопухолевым лимфотропным и др., действием.

Также актуальным является расширение арсенала методов определения под-линности. Это может быть сделано в настоящее время, в частности с привлече-нием наиболее современных и перспективных молекулярно-биологических ме-тодов.

Известно, что манжетки способны образовывать агамный комплекс (V.Grant, 1981), который находится на стадии поздней зрелости и его агамоспермная су-перструктура достигает полного развития.Такие популяции являются непрерыв ным источником возникновения агамоспермных микровидов.

В роде манжетка выделено четыре группы, одна из которых – Vulgares не яв-ляется монотипной и её границы до сих пор не ясны (S. Fröhner, 1986),так как описано несколько амфимиктических видов и множество апомиктических ага-мных видов. Манжетки этой группы предложено трактовать, как агамный ком-плекс (V.Grant, 1981). Для некоторых из них в пределах Европейской части России установлен факультативный апомиксис (К.П.Глазунова, 1977,1987). У манжетки обыкновенной высокая изменчивость проявляется в наличии много-численных форм,групп особей или отдельных экземпляров,среди которых мно-гие агамные виды описаны по морфологическим признакам: опушение, разме-ры и геометрическая форма вегетативных, генеративных органов или их частей. Кроме того, отмечено наличие многочисленных переходных форм и значитель-ные колебания хромосомных чисел от 64 до 146. Только на территории Евро-пейской части нашей страны описано более 56 видов манжетки. Некоторые ис-следователи относят к манжетке обыкновенной пять-шесть агамных видов, та-ких как м. балтийская, м. изящная, м.остролопастная, м. близкая, м. горная и м. голостебельная (К.П. Глазунова, 1990). Другие исследователи к популяции ман-жетка обыкновенная относят до двенадцати видов (С.К. Черепанов,1981), также с дискретно различающимися морфологическими вариантами, при этом часто их принадлежность к группе манжетка обыкновенная не совпадает у раз-ных авторов.

Всё это затрудняет фармакогностическое изучение этих ценных лекарствен-ных растений, разработку рекомендаций по сбору сырья и его осуществление.

Недостаточность одних лишь морфологических признаков для выявления внутрипопуляционной и внутривидовой изменчивости в роде манжетка заста-вило прибегнуть к привлечению дополнительных молекулярно-биологических методов, в частности, для характеристики геномов.

Для многих других ценных лекарственных растений идентификация также не разработана на должном современном уровне, поэтому разработка методичес-ких подходов к изучению лекарственных растений с использованием молеку-лярно-биологических методов актуальна.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с научным направлением кафедры фармакогнозии и является фрагментом разрабатываемой комплексной темы: «Фармакогностическое изучение лекарственного растительного сырья, лекарственных сборов, лекарственных форм из сырья и разработка методов их стандартизации с учётом антропогенных факторов», № 01.200.110546.

Молекулярно-биологическая часть эксперимента выполнена в отделе эволю-ционной биохимии НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, по теме: «Геносистематика и молекулярная фило-генетика про- и эукариот», № госрегистации: 0187.0095927



Цель и задачи исследования. Цель исследования – разработать методичес-кие подходы к изучению лекарственных растений, обладающих аберратными формами размножения, используя молекулярно-биологические и фармакогнос-тические методы, направленные на прогнозирование перспективных сырьевых источников получения отечественных лекарственных средств. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Определить характер изменчивости в популяциях модельного рода манжетка – Alchemilla L., с помощью полимеразной цепной реакции со случайными прай- мерами (RAPD-метод)

2. Оценить внутривидовую и популяционную изменчивость на фоне отсутствия корреляции с внешними устойчивыми морфологическими признаками его видов.

3. Изучить возможность применения характеристик геномов в фармакогности-ческом анализе. Провести сравнительное изучение с использованием RAPD-анализа лекарственных растений различных семейств, родов и разных морфо-логических групп.

4. Показать возможность использования для изучения перспективных и лекар-ственных растений секвенирования ДНК с использованием последовательнос-тей внутренних транскрибируемых спейсеров рибосомного оперона яд ДНК (ITS 1-2),хлоропластного интрона гена rps16 (rps16) и хлоропластного маркера, включающего участок экзона petB, межгенный спейсер и интрон гена petD (petB-petD) и на примере рода Аnthylis L., Провести филогенетический анализ видов рода Anthyllis и близких родов.

5. Провести изучение химического состава полифенолов и аминокислот ман-жетки, исследовать его взаимосвязь со строением геномов лекарственных рас-тений.

6. Изучить вопросы стандартизации сырья трава манжетки, разработать крите-рии идентификации (внешние и анатомические признаки, качественные харак-теристики), числовые показатели и установить их нормы.

7. Выявить природные запасы и определить урожайность травы манжетки.

8. Разработать алгоритм изучения перспективных лекарственных растений с аберратными формами размножения.

Научная новизна результатов исследования. Показана возможность при-менения молекулярно-биологических методов для фармакогностического ана-лиза. С использованием RAPD-анализа, на примере рода манжетка проведено изучение геномов перспективных лекарственных растений, определён характер изменчивости в популяциях рода и установлена генетическая дистанция между видами рода, что позволило подойти к решению проблемы внутривидовой и популяционной изменчивости.

Изучена взаимосвязь между особенностью строения геномов видов манжетки и химическим составом полифенольного и аминокислотного комплекса. Изуче-ние полифенольного и аминокислотного состава травы манжетки от разных про изводящих видов показало его сходство и позволило дать чёткие рекомендации по сбору сырья.

Показана перспективность применения молекулярно-биологических методов, RAPD-анализа и секвенирования для изучения лекарственных растений и для идентификации лекарственного растительного сырья на примере сырья расте-ний семейства розоцветные, бобовые, яснотковые, буковые, гречишные, кип-рейные, астровые.

Проведено изучение сырьевой базы травы манжетки, установлены границы полиморфизма Alchеmilla vulgaris L., что позволило определить урожайность, при ежегодных заготовках с соблюдением ресурсосберегающих условий.

Разработаны критерии оценки подлинности и качества сырья – трава ман-жетки, как перспективного лекарственного сырья для отечественной медицины.

Исследование безопасности настоя травы манжетки показало, что он может быть отнесен к группе практически нетоксических средств, так как однократ-ное введение в желудок максимально возможной дозы настоя травы манжетки не вызывало гибели животных в течение двух недель наблюдения, кроме того, выявлена его антиметастатическая активность.

Разработан алгоритм изучения лекарственных растений народной медицины, (в том числе и для - обладающих аберратными формами размножения).

Практическая значимость полученных результатов. Нами показана воз-можность применения молекулярно-биологических методов для идентифика-ции лекарственного растительного сырья.

Разработаны оптимальные методики для идентификации свежего и высу-шенного лекарственного растительного сырья с использованием RAPD-анали-за. С использованием молекулярно-биологических и традиционных фармако-пейных методов установлены характеристики подлинности и качества травы манжетки и разработаны проект Фармакопейной статьи «Трава манжетки», проект «Инструкции по сбору и сушке», а также проект Общей фармакопей-ной статьи «RAPD-анализ лекарственного растительного сырья».

Изучены сырьевая база и вопросы стандартизации сырья трава манжетки, в том числе подобрана методика количественного определения суммы флавоно-идов, определён и выделен ценный полифенол, обладающий противоопухоле-вой активностью – агримониин.

На основании изучения геномов и полифенольного комплекса для медицин-ского применения рекомендованы 12 видов рода Alchemilla L. Данные филоге-нетического анализа и ботанико-фармакогностического изучения легли в осно-ву проекта инструкции по заготовке сырья трава манжетки.

С помощью RAPD-анализа даны геномные характеристики 17-ти видам растительного сырья.

Положения, выносимые на защиту:

1. Результаты оценки сравнительного изучения геномов различных видов рода манжетка – Alchemilla L., с использованием RAPD-анализа и определение характера изменчивости.

2. Данные применения RAPD-анализа для идентификации лекарственного растительного сырья.

3. Результаты применения секвенирования ДНК лекарственных растений для их фармакогностического изучения.

4. Результаты изучения взаимосвязи строения геномов с содержанием полифе-нолов и аминокислот для изучаемых видов рода манжетка.

5. Результаты изучения запасов травы манжетки.

6. Данные по стандартизации травы манжетки.

7. Результаты разработки алгоритма изучения перспективных видов лекарст-венных растений с использованием молекулярно-биологических и фармако-гностических методов.



Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на Российской национальной конференции «Формирование приорететов лекарст-венной политики (Москва, 28-29 июля 1995), на Первом международном сим-позиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования» (Пущино, 1-5 августа 1995), на научной конференции, посвя-щенной 50-летию ботанического сада ММА им.И.М. Сеченова (Москва, 1996), на Международном конгрессе по аналитической химии (Россия, 1997), на У и УШ Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва. 21-25 апреля 1998, и 2001), на научно-практической конференции «Традиционные методы лечения – основные направления и перспективы развития» (Москва,14-16 мая 1998), на интернациональном симпозиуме «Plant Evolution in Man-made Habitats” (Vena, August 10-15, 1998), на заседании Московского общества фито-терапевтов (Москва, ноябрь, 2000), на У1 Симпозиуме по фенольным соедине-ниям (Москва, 28-30 апреля 2004г),на научно-практической конференции «Со-временные методы стандартизации и контроля качества лекарственных средств» Москва, (30 мая 2006); на Международном конгрессе «Традиционная медицина 2007» (1-3марта 2007г).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 40 печатных работ в том числе в рецензируемых журналах - 9.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 236 страницах машинописного текста, содержит 77 ри-сунков, 38 таблиц и 3 приложения. Состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, 5 глав экспериментальных иссле-дований, общих выводов, списка литературы (250 источников, в том числе 118 на иностранных языках).

В обзоре литературы представлен анализ современного состояния проблемы изучения геномов растений, геносистематики, полиморфизма лекарственных растений показана перспективность использования молекулярно-биологичес-ких методов для решения сложных задач при изучении перспективных лекар-ственных растений, обладающих аберратными формами размножения. Охарактеризован агамно-половой комплекс Alchemilla vulgаris L.- как источ-ник ценного лекарственного сырья, его химический состав и перспективы при-менения.

Вторая глава посвящена описанию объектов исследования, методик и мето-дов анализа, использованных в работе.

В третьей главе приведены результаты применения RAPD-анализа при изу-чении самых распространённых видов рода Alchemilla, что позволило очертить круг производящих лекарственных растений для сырья – трава манжетки. Показана возможность практического применения полученных результатов по-зволивших предложить новый метод изучения лекарственных растений и ис-пользовать его для идентификации лекарственного растительного сырья.

В четвёртой главе показаны перспективы использования молекулярно-биоло-гических методов для изучения лекарственных растений: секвенирование ДНК растений (на примере рода Аnthylis L.) и RAPD-анализ различных видов сырья..

В пятой главе представлены результаты химического изучения наиболее распространенных видов рода Alchemilla и фракционное изучение полифено-лов травы манжетки, а также изучения её аминокислотного и элементного состава.

Шестая глава посвящена фамакогностическому изучению травы манжетки и практическому применению полученных результатов.

В седьмой главе представлены результаты оценки антиметастатической ак-тивности, острой и хронической токсичности водных извлечений травы ман-жетки.

В приложении представлены проекты нормативных документов по примене-нию RAPD-анализа для идентификации лекарственного растительного сырья, Иструкции по сбору и сушке травы манжетки-herba Alchemillaе, Фармакопей-ной статьи трава манжетки - herba Alchemillaе.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Объекты и методы исследования.

В качестве объектов исследования были собраны следующие виды Alchemilla L.: манжетка голостебельная - Alchemilla glabricaulus Lindb.fil., манжетка ост-ролопастная - Аlchemilla acutiloba Opiz., манжетка балтийская - Alchemilla bal-tica G. Sam.ex Juz., манжетка шерстистая - Alchemilla hirsuticaulus Lindb.fil., манжетка близкая - Аlchemilla propinqua Lindb.fil.,манжетка горная - Alchemilla monticola Opiz., манжетка семиугольная - Alchemilla heptagona Juz., манжетка изящная - Alchemila gracilis Opiz., манжетка городчатая - Alchemilla subcrenata Buser., манжетка сарматская - Alchemilla sarmatica Juz.,манжетка полулунная-Alchemilla semilunaris Alech., манжетка волнистолистная – Alchemilla cymato-phylla Juz., манжетка шаровидно-скрученная –Alchemilla conglobata Lindb.fil (A.Juzepzukii Alеch.).

Определение дикорастущих видов проводили по ключам-определителям, разработанным С.В. Юзепчуком (1939г.) и В.Н.Тихомировым (1966 г.).

Выделение ДНК. ДНК выделяли с помощью модифицированной нами методи-ки Дж. Дрейпера (1989) с использованием экстракции цетилтриметиламмония бромидом. Концентрацию ДНК оценивали с помощью спектрофотометрии или электрофореза в агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием.

Выделение ДНК и сравнение геномов сначала проводили у хорошо определя-емых видов и близких родов:манжетка (Alchemilla gracilis Opiz.) и лапчатка (Po- tentilla erecta Hampe.),а также репешок (Agrimonia eupatoria L.), собранных в Истринском районе Московской области. Там же собирали цветки таволги (Fi-lipendula ulmaria Max.) и лепестки розы (Rosa rugosa Thunb., ceм. Rosaceae), траву горца почечуйного (Polygonum persicaria L., ceм. Polygonaceae), череды трёхраздельной (Bidens tripartitus L.) и поникшей (Bidens cernuus L. ceм. Astera-ceae).

Листья дуба черешчатого и красного (Quercus robur L. и Quercus rubra L. ceм. Fagaceae) и траву язвенника (Anthylis vulneraria L.,сем. Fabaceae) собирали в ботаническом саду МГУ им.М.В.Ломоносова. Образцы других видов рода Anthylis были любезно предоставлены нам из коллекций гербариев МW, MHA, LE и др.

Цветки иван-чая узколистного (Chamaenerium angustifolium (L.) Scop. и Ch. аngustifolium var. albiflorum Hausskn., ceм. Onagraceae.) обычные и белой рассы собирали в Одинцовском районе Московской области.

Листья мяты перечной (Мentha piperita L.) и монарды двойной (Monarda di-dyma L.),траву чабреца (Thymus serpillum L.) и мелиссы (Melissa officinalis L., сeм. Lamiaceae) собирали в ботаническом саду ГОУ ВПО ММА им.И.М. Сече-нова. Цветки боярышника собирали там же с боярышника кроваво-красного (Crataegus sanquinea Pall.), а цветки боярышника кавказского (Crataegus cau-casica C. Koch.,Cratz.et Mesp.) собирали на Черноморском Побережье в Гагрин-ском районе Абхазии. Для геномного анализа использовали листья перечислен-ных выше видов манжетки, собранных в разных районах Московской области.

Для построения филогении язвенника использовали молекулярные маркеры применяемые в геносистематике: внутренний транскрибируемый спейсер-inter-nal transcribed spacer(ITS1 и ITS2)участок 18S-5.8S-26S ядерного рибосомально-го цистрона-участок ДНК, отвечающий за единичную функцию (I.Alwres,2003); хлоропластный участок petB-petD относящийся к интронам II группы и состоя-щий из куска экзона petB, межгенного спейсера, экзона petD, интрона и куска экзона petD(C.Lohne, 2005);а также хлоропластный маркер экзон rps16 из груп-пы II интронов (M.Clegg,1993; B.Oxelman,1997).

Определение нуклеотидных последовательностей ДНК для язвенника прово-дили методом циклического секвенирования с использованием набора реаген-тов ABI Prism BigDye Terminator v. 3.1. с последующим анализом продуктов на

автоматическом секвенаторе ДНК ABI Prism 3100-Avant (Applied Biosystems) в Межинститутском Центре коллективного пользования «Геном» (Институт мо-лекулярной биологии РАН им. В.А. Энгельгардта).

Для изображения филогенетических деревьев использовали методы макси-мальной экономии, максимального правдоподобия и дистанционный.

Для исследований ценопопуляций манжетки была использована методика сбора и обработки материала, а также терминология, разработанная А.А.Урано-вым и его учениками (1973, 1975, 1980, 1987). Были рассмотрены разновозраст-ные популяции изучаемых видов манжетки. В качестве единицы счёта исполь-зовали, как элементарный источник фитогенного поля, особь.

При описании структуры и динамики ценопопуляций сбор сырья проводили в пределах одного участка ассоциации S=100 м² (10х10) внутри её контура, на трансектах (метод трансект Л.Б.Заугольновой, 1976). В ресурсоведческой рабо-те использовали методики разработанные А.И.Шретером (1966), и В.Б.Кувае-вым (1987). Урожайность сырья или плотность запаса рассчитывали на едини-цу площади (ц/га).

Фармакогностическое изучение сырья - трава манжетки: описание внешних признаков, микроскопический анализ, определение числовых показателей (вла-жность, зола общая и др.) проводили по фармакопейным методикам ГФ ХI, т.1 (1987) и т.2 (1990).

Водные извлечения из сырья готовили в соответствии с ГФ ХI, т.2(1990) в со-отношении 1:10. Извлечения 30% спиртом, 70% спиртом и ацетоном готовили в соотношении 1:10.

  1   2   3   4   5


База данных защищена авторским правом ©bezogr.ru 2016
обратиться к администрации

    Главная страница