Биологически активные вещества, продуцируемые бактериями рода Bacillus



Скачать 217.88 Kb.
Дата08.11.2016
Размер217.88 Kb.


Биологически активные вещества, продуцируемые бактериями рода Bacillus
Грязнева Т.Н.
ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и био­технологии имени К.И. Скрябина»
Антимикробные вещества, продуцируемые бациллами. Перспективным направлением в конструировании и совершенствовании пробиотиков является применение бактерий рода Bacillus. Эти микроорганизмы широко распространены в природе, являются устойчивыми к литическим и пищеварительным ферментам, длительно сохраняют жизнеспособность в желудочно-кишечном тракте животных.

Среди различных представителей экзогенной микрофлоры, бациллы характеризуются рядом преимуществ, которые позволяют считать их наиболее эффективными в качестве основы новых пробиотиков. Эти бактерии (кроме B.anthracis и B.cereus), как правило, являются безвредными для организма животных даже в высоких концентрациях; обладают антагонистической активностью к широкому спектру патогенных и условно патогенных микроорганизмов; характеризуются высокой ферментативной активностью, что может обусловить существенное регулирование и стимулирование пищеварения; способны оказывать противоаллергенное и антитоксическое действие; технологичны в производстве и стабильны при хранении.

Важная особенность бацилл состоит в том, что хорошо изучена их генетика и поэтому они являются перспективной системой для клонирования чужеродных генов.

В настоящее время методами генетической инженерии на основе аэробных спорообразующих бактерий получены суперпродуценты различных биологически активных веществ (колицин Е2 и др). Это открывает перспективу конструирования на основе бацилл штаммов с заданными свойствами и использования их новых свойств.

В 90-х годах прошлого века в медицинской практике проводились широкие испытания препарата «Биоспорин», созданного сотрудниками института микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, на основе штаммов B.subtilis ВКПМ № 2335 и B.licheniformis ВКПМ № 2336.

Было установлено, что «Биоспорин» более эффективен по сравнению не только с пробиотиками из представителей нормального микробиоценоза желудочно-кишечного тракта (типа бифидумбактерина, лактобактерина или колибактерина), но и в сравнении с препаратами на основе монопрописей спорообразующих бактерий (бактисубтил, споробактерин).


Таблица 1. Антибиотики, продуцируемые B.subtilis


Год открытия

Антибиотик

1911

Трипанотоксин

1944

Субтилин

1945

Субтилизин

1946

Эндосубтилизин, Бациллин

1947

Бацилломицин

1948

Субтенолин

1949

Ризос тонна-фактор, Микосубтилин, Аспергиллюс-фактор, Бацилизин, Бацилипин

1950

Итурин

1951

Обутин, Ксантелин, Бацилломиксин

1952

Флювомииин, Ризобацидин, Фунгоцин, Токсимицин, Глобицин

1955

Датемицин

1956

Антибиотик В-456

1958

Микобациллин, Петрин

1964

Антибиотик 49-4

1965

Полихлорсубтилин

1969

Субспорин

1975

Антибиотик 61-26, Антибиотик TL-119

1978

Антибиотик 26а

1979

Антибиотик 3, Полимиксин, Колистин, Бацитрацин, Тироцидин, Грамицидин С, Эдеин, Бутирозин

Количество известных антибиотиков, продуцируемых спорообразующими аэробными бактериями, в настоящее время приближается к 200. По количеству продуцируемых антибиотических веществ микроорганизмы рода Bacillus уступают лишь актиномицетам.

В доступной литературе описано более 70 различных антибиотиков, продуцируемых бактериями рода Bacillus. Некоторые из них уже широко применяются в медицине, ветеринарии, сельском хозяй­стве, пищевой промышленности и др. Это полимиксины, колистин, бацитрацин, тиротрициновый комплекс (линейный грамицидин + тироцидин), грамицидин С, субтилин, эдеин, бутирозин.

Большинство идентифицированных антибиотиков, продуцируемых бактериями рода Bacillus – пептиды, вместе с тем, в последние годы все больше сообщений свидетельствуют о том, что представители данной группы микроорганизмов продуцируют антибиотические вещества, относящиеся и к другим классам соединений.

Образование антибиотиков происходит обычно в логарифми­ческой фазе роста для многих продуцентов, однако для спорообразующих бактерий свойственны и другие сроки их продукции.

Образование пептидных антибиотиков у бацилл контролируется азотной и углеродной репрессией; вли­яние репрессии на эти процессы может изменять взаимосвязь между характером роста культур и количеством образуемых антибиотиков.

Снижение синтеза антибиотика бациллами обуслов­лено не катаболитной репрессией углеродом, а изменением рН среды, вызванным микробным метаболизмом. Этот вывод базировался на обратном эффекте, наблюдаемом при добавлении в питательную среду CaCO3. В дальнейшем установлено, что подавление синтеза антибиотика определяется не изменением pH среды, а образованием из глюкозы органических кислот (уксусной и пировоградной). Их нейтрализация снимает ингибирование синтеза антибиотиков.

Таким образом, пептидные антибиотики синтезируются бациллами-продуцентами в стадии активного роста. Расшифровка механизмов продукции антибиотиков способствует прогрессу исследований, связанных с внеклеточным синтезом пептид­ных антибиотиков. Внеклеточный синтез грамицидина, тироцидина, грамицидина линейного, эдеина, бацитрацина, колистина и микобациллина детально освещен в работах ученых в 70-х годах 20 века.

Биосинтетические системы бацилл, в которых происходит образование на­званных выше полипептидных антибиотиков, отличаются от систем, в которых синтезируется белок. Необходимые условия для синтеза антибиотика включают, как правило, следующие компоненты: амино­кислоты, аденозин-5-трифосфат, ионы магния, редуцирующий агент и свободную от клеток надосадочную жидкость - центрифугат культуральной жидкости.

Синтезируемые бактериями рода Bacillus антибиотики подразделя­ются на следующие классы:

- основные пептиды (например, эдеин), подавляющие образование 30 S-рибосомальных комплексов и ингибирующие синтез ДНК;

- циклические олигопептиды (например, бацитрацин), подавляющие синтез клеточных стенок;

- линейные или циклические олигопептиды, нарушающие функции мембран - грамицидин, тироцидин В или ингибирующие синтез РНК - например, тиротрицин;

- аминогликозидные антибиотики - бутирозин.

В последние годы было достоверно установлено, что B.subtilis продуцирует такие антибиотики, как атерримин, aspergillus-фактор, бацилипин, бацилизин, бацилломиксин, бациллин, бульбифор-мин, глобицин, датемицин, дебариоцидин, истеидин, итурин, ксантелин, микосубтилин, микобаииллин, неоцидин, обутин, петрин, полихлоросубтилин, ризобацидин, ризостониа-фактор, субтилин, субтенолин, субтенолизин, субтилизин, субспорин, токсимицин, трипанотоксин, фунгистатин, фунгоцин, флювомицин, эндосубтилизин, эумицин, антибиотики 49-4, 6633, 26а, В-456, 3, бацилломицин.

Атерримин образуется темнопигментным штаммом В.subtilis v.aterrimus. В 1957 г. из культуры выделены два анти­биотических вещества, близкие по природе — атерримины А и В, ко­торые представляют собой лактоны. Атерримины А и В характеризуются выраженным антибиотическим действием на грамположительные бактерии.

Aspergillus-фактор - антибиотическое вещество, которое получил в 1949 г. Michener М. из культуры В.subtilis 6633. Природа антибиотика не изучена. В небольших концентрациях оказывает выраженное дей­ствие на различные виды грибов и дрожжей.

Субтилин был выделен из культурального фильтрата штамма В.subtilis 6633. Этот антибиотик подавляет рост ряда микроорганизмов: R.nigricans - в дозе 8,1 мкг/мл; R.solani - 0,4; S.bataticola - 3,5; S.fructicola - 5,9; P.digitatum - 6,2; A.niger - 9,9; B.cinerea - 4,8 мкг/мг.

Бацилипины А и В описаны в 1949 г. Эти антибиотики получены из культуры В.subtilis. Бацилипины А и В оказывают выраженное бактериостатическое действие на M.phlei, S.aureus, C.diphteriae, В.anthracis, S.enteritidis, S.typhi, E.coli.

Бацилизин - антибиотик, который так же, как и бацилипины А и В, получен в 1949 г. из культуры В.subtilis. Антибиотик представляет собой пептид, содержащий аминокислоты: аланин, тирозин, лейцин, фенилаланин, серусодержащую аминокислоту. Оказывает бактерицидное действие на M.phlei, S.aureus, C.xerose, E.coli.

Бацилломиксин - антибиотический комплекс, опи­санный в 1951 г., представляет собой полипептид, в составе которого имеются глютаминовая и аспарагиновая аминокислоты, тирозин, серии и треонин.

Бацилломицин - антибиотик, полученный в 1947 г., характеризуется высокой избирательной активностью против па­тогенных грибов и дрожжей. В дозах 0,025 мкг/мл подавляет рост М.andonini, M.gypseum, T.rubrum, T.schonleini, E.floccosum, B.brasiliens, C.immitis, H.capsulatum, M.apiospormum.

Бациллин - антибиотик, полученный из культуры В.subtilis в 1946 г. Подавляет рост грамположительных микроорганизмов (S.aureus, S.albus, S.pyogenes, S.lanceolatus) и грамотрицательных (Е.coli, S.parathyphi, Pasterella sp.). Вве­дение бациллина мышам внутрибрюшинно в дозе до 1000 мг/кг не вызы­вает патологических изменений.

Бульбиформин выделен в 1952 г. в виде концентрата. Подавляет рост грибов, не активен в от­ношении бактерий. Природа этого антибиотика не изучена.

Глобицин получен из культуры В.subtilis в 1952 г. В дозе 10 мкг/мл подавляет рост S.aureus, В.cereus, M.phlei, M.avium.

Датемицин - антибиотик, полученный в 1955 г., оказывает угнетающее действие на рост различных грибов в дозах 50-100 мкг/мл.

Дебариоцидин выделен в 1958 г. Задерживает рост некоторых видов дрожжеподобных грибов.

Истеидин - антибиотик, выделенный в 1959 г. Подавляет рост грибов и дрожжей.

Итурин синтезируется культурой В.subtilis v.ituriensis. Выделен в 1950 г. Антибио­тик подавляет рост Е.coli, S.marcescens, S.aureus, Corynebacterium. Более выраженное действие итурин оказывает на грибы, в том чис­ле, на патогенные для человека и животных.

Ксантелин получен в 1951 г. Подавля­ет рост грамположительных, грамотрицательных, кислотоустойчивых бактерий. Оказывает угнетающее действие на возбудителей бруцеллеза.

Микосубтилин — антибиотик, синтезируемый куль­турами В.subtilis, которые продуцируют также субтилин. Микосубтилин высокоактивен в отношении ряда грибов и дрожжей. В дозе 1,5 мкг/мл подавляет рост Trichophyton sp. и U.zeae, в дозе 2,5 мкг/мл - S.fructicola, в дозе 3,75 мкг/мл оказывает угнетающее действие на T.delbruckii, Hansenulaanomala, в дозе 5,0 мкг/мл - нa T.cremoris, S.rosens, C.neoformans, M.audouini, R.rubra, A.schonleini.

Микобациллин выделен и описан в 1958. В дозах 0,02 мкг/мл подавляет рост A.niger, C.albicans. Успешно применяется при лечении грибковых поражений кожи. Подавляет также рост грибов - возбудителей некоторых болезней растений.

Неоцидин — антибиотический концентрат, выделенный из культуры В.subtilis в 1951 г. Характеризуется бактериологическим действием на грамположительные бактерии М.tuberculosis avium.

Обутин получен в 1951 г. И проявляет антибактериаль­ную активность я в отношении S.aureus, В.anthracis. По антибиотическим свойствам сходен с неоцидином.

Петрин — антибиотик, полученный в 1958 г. В дозах 6,7-40 мкг/мл подавляет рост N.meningi­tis, H.pertussis, H.parapertussis, H.ihfluenzae, N.gonorrhoeae, C.diphteriae.

Полихлорсубтилин описан в 1965 г. Действует преимущественно на грамотрицательные микроорганиз­мы.

Ризобацидин выделен в 1952 г. в кристаллическом виде. Пред­ставляет собой пептид, оказывающий антибиотическое действие на возбудителей заболеваний растений.

Ризостониа-фактор получен из культуры В.sub­tilis 6633. Описан в 1949 г. Характеризуется избира­тельной активностью в отношении ряда микроскопических грибов и дрожжей. Получен из водного раствора культуры, которая использу­ется для производства субтилина. Ризостониа-фактор обладает антифунгальными свойствами. Угнетает рост Rothium sp. в дозе 270 мкг/мл, R.nigricans - 160, R.solani - 45, S.bataticola - 64, S.fructicola - 14, P.digitatum - 68, B.cinerea - 6,4 мкг/мл.

Субтилин продуцируется культурой В.subtilis NRRL-B 545. Характеризуется выраженным бактерицидным действием на многие, в том числе патогенные, микроорганизмы. Высокоактивен, в частности, против T.pallidum, S.aureus, В.anthracis, В.cereus, Neisseria, M.tuberculosis. Успешно применяется в пищевой промышленности как консервант, особенно в производстве консервов из скоропортящихся продуктов. Прибавление небольших доз этого антибиотика позволяет значительно уменьшить время стерилизации, что обеспечивает сохранение естест­венного цвета консервируемых продуктов, особенно фруктов.

Субтенолин выделен в 1948 г. Подавляет рост некоторых грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов: в дозе 16,5-22,5 мкг/мл - Pasteureulla sp.; в дозе 140-200 мкг/мл - S.aureus; 165 мкг/мл - S.typhi.

Субтилизин описан в 1945. Обладает ферментными свойствами: лизирует Е. coli, C.septicum, C.oedematiens, S.enteritidis, Pasteurella sp. в дозах 20 - 50 мкг/мл. Полученный из этой же культуры препарат анализин по своим свойствам аналогичен субтилизину.

Субспорин — комплекс антибиотических веществ, обра­зуемых штаммом В.subtilis PCI-219. Известны субспорины А, В и С. Активность субспорина А не снижается после воздействия хемо-трипсина, пепсина или карбоксипептидазы. Проявляет высокую анти­биотическую активность по отношению к некоторым видам грибов и дрожжей.

Токсимицин получен в 1952 г. в виде концент­рата. Прояв­ляет антибиотические свойства в отношении фитопатогенных грибов и В.cereus. Обладает также антивирусными свойствами.

Трипанотоксин, выделенный в 1911 г., подавляет рост Spirillum и Leishmania.

Фунгистатин (синоним - антибиотик XG) описан в 1946 г. Характеризуется выраженным антибиотическим действием в отноше­нии некоторых грибов, патогенных для человека, животных и расте­ний. В дозах 4-10 мкг/мл подавляет рост T.gypseum, E.floccosum, Rhodotorula, M.alpicans.

Фунгоцин описан в 1952 г. По антибиоти­ческим свойствам сходен с фунгистатином и бацилломицином. Обладает противогрибной активностью. Антибиотик не диализируется, адсор­бируется на активированном угле. Не инактивируется пепсином или трипсином. Не растворяется в воде, эфире, хлороформе. Молекулярная масса 1100Д.

Флювомицин (синонимы: Efsiomycin, Vivicil, Riomycin) — антибиотик, образуемый культурой В.subtilis FC-5036. Выделен в 1952 г. Наиболее выраженное действие оказывает на S.aureus, P.vulgaris, E.coli и C.albicans.

Эндосубтилизин — антибиотик, описанный в 1946 г. В дозах 1 мкг/мл подавляет рост S.aureus, в боль­ших дозах - S.haemolyticus и M.tuberculosis.

Эумицин открыт в 1946 г. Оказывает наиболее выраженное антибио­тическое действие в дозе 5 мкг/мл на C.diphteria.

Среди бактерий вида В.subtilis описаны продуценты нескольких антибиотиков, которым еще не присвоены названия. Это такие, как антибиотик 26а, антибиотик TL-119, антибиотик В-456, антибиотик 49-4, антибиотик 61-26 и антибиотик, продуцируемый штаммом В.subtilis 3.

В 1978 г. Jarosz J. опубликовал данные о поли­пептидном антибиотике, полученном из культуры В.subtilis 26a. Продуцент антибиотика - В.subtilis 26a – был изолирован из кишеч­ника личинки большой восковой моли. Указанный штамм продуцирует несколько биологически активных веществ, находящихся в смеси: это полипептидный антибиотик типа бацитрацина, бактериальный фермент, характеризующийся эндо-β-N-ацетилмура-мидгликаногидролазной активностью и неидентифицированное активное вещество. Антибиотик образуется преимущественно в стационарной фазе раз­вития культуры — в то время, когда происходит споруляция. В составе препарата обнаружено 12 остатков аминокислот, в их числе глютаминовая, изолейцин, лейцин, фенилаланин, лизин, гистидин, орнитин и цистин.

Антибиотик 26а не инактивируется сывороткой крови; не снижает активности под влиянием пепсина, трипсина, липазы. Максимальную антибиотическую активность проявляет в отношении микрококков и бацилл в дозах 0,078—0,3 мкг/мл. По спектру антимикробного дейст­вия антибиотик близок к пенициллину, бацитрацину и лизоциму.

В 1975 г. был выделен антибиотик TL-119, синтезиру­емый культурой В.subtilis TL-119, изолированной из почвы Таиланда. Молекулярная масса антибиотика TL-119 - 800Д; он отнесен к полипептидам. В составе антибио­тика определены следующие аминокислоты: фенилаланин, треонин, аланин, валин и лейцин.

Об антибиотике В-456, образуемом В.subti­lis, сообщил в 1956 г. Tanaka. Этот антибиотик представляет собой препарат полипептидной природы и содержит d-тирозин. Обладает про­тивогрибным действием.

Антибиотик 49-4 продуцируется культурой В.subtilis DINR-49-4. Описан в 1964 г. Получены три полипептидные фракции. Аминокислотный состав всех трех фракций оказался сходным: аспарагиновая и глютаминовая кислоты, пролин, серии, тирозин. Биологическая активность фракций различалась. Первая наиболее активна в отношении Neurospora crassa; вторая - Penicillium chrysogenum, третья - Trichophyton tonsurans. Все три выделенные антибиотические вещества - полипеп­тиды и отнесены к группе бацилломицина. Различаются по содержанию в них пролина.

Антибиотик 61-26 образуется культурой В. subtilis 61-26, изолированной из почв Новой Гвинеи. Описан в 1975 г. Анализ ИК-спектров показал, что антибиотик 61-26 является пептидом, содержащим лактон или эфирную связь (предположительные данные). Молекулярная масса около 1200Д. Содержит следую­щие аминокислоты: аспарагиновую, серии, валин и изолейцин. Препарат 61-26 оказывает антибиотическое действие на грамполо-жительные бактерии, некоторые грибы и дрожжи, в том числе патоген­ные для человека и животных.

В 1979 г. Харченко С.Н. и соавт. описали способ борьбы с плесневением кормов при использовании штам­ма В.subtilis 3. Этот штамм продуцирует антибиотик, подавляющий рост некоторых грибов (Stachybotris alternans Bonord и Dendrodochium toxicum), а также патогенных и условно патогенных бактерий: Е.coli, P.vulgaris, Ps. aeruginosa, В.anthracis, C. albicans. Согласно предварительным данным о хими­ческой природе антибиотика, это - низкомолекулярный полипептид, в составе которого обнаружены фенилаланин, гистидин, аспарагиновая кислота. Антибиотик растворим в воде, его водные растворы стойкие.

Штамм В.subtilis 3 используется в сельском хозяйстве для борь­бы с плесневением кормов, вызываемым такими грибами, как Stachy­botris alternans и Dendrodochium toxicum. Обработка кормов (солома, сено) осуществляется аэрозольным способом с использованием суспен­зии культуры в разведении 500 млрд. клеток на 10 л воды.

Микологическими исследованиями установлено, что при обработке культурой, например, соломы, пораженной Stachybotris alternans, количество высеваемых из обработанного субстрата колоний гриба сни­жается в зависимости от продолжительности и контакта микромицета с антагонистом: через две недели - в 6 раз, через месяц - в 23-25 раз. Кроме того, у животных отмечается снижение заболеваемости желудочно-кишечными болезнями.

Таким образом, можно констатировать, что бациллы, и в первую очередь, B.subtilis, характеризуются широким спектром продуцируемых ими антибиотических веществ, обуславливающих их высокую антагонистическую активность в отношении различных микроорганизмов. Поэтому, создание препаратов на основе бацилл или их метаболитов, является принципиально новым подходом к лечению бактериальных, вирусных, грибных и смешанных инфекций.

Биосинтез бактериями рода Bacillus ферментов, аминокислот и других биологически активных веществ. По данным отечественных и зарубежных ученых бактерии рода Bacillus характеризуются полиферментативными свойствами. Клетки бацилл включают набор ферментов раз­личных классов, что обеспечивает им возможность существовать в разно­образных субстратах.

У бацилл особенно хорошо развита система гидролаз - ферментов, катализирующих реакции гидролитического расщепления молекул. Среди гидролаз практический интерес представляют протеолитические ферменты, составляющие особый подкласс пептид-гидролаз.

Основной функцией протеолитических ферментов является расщеп­ление белков, содержащихся в окружающей среде, и превращение их в форму, способную легко проникать внутрь клетки. В связи с этим большинство известных протеаз функционируют как экстрацеллюлярные ферменты. Большинство пептидаз являются внутриклеточными фер­ментами.

Внеклеточные протеазы, кроме основных функций - катализа гид­ролиза экзогенных белковых субстратов, принимают участие в разло­жении вегетативного клеточного материала для последующего исполь­зования в анаболических и катаболических реакциях. Протеазы В.subtilis играют большую роль в разрушении белковых оболочек спор во время их прорастания.

Инициация споруляции обусловлена расщеплением внекле­точной сериновой протеазой β-субъединицы РНК-полимеразы, что приводит к изменению ее матричной специфичности и превращению в РНК-полимеразу спорулирующих клеток.

Имеются данные о том, что протеазы снимают действие белковых ингибиторов споруляции. Анализ аспорогенных мутантов у представителей рода Bacillus показал, что многие из них не образуют внеклеточной протеазы и что реверсия к спорообразованию сопровождается способностью продуцировать протеазу. Высказывается предпо­ложение об участии внеклеточных протеаз в синтезе полипептидных антибиотиков.

Наиболее активными продуцентами внеклеточных протеаз являются В.subtilis и В.mesentericus.
Таблица 2. Ферменты, обнаруженные у представителей рода Bacillus


Класс

Тривиальное название

Оксидоредуктазы

l–Лактатдегидрогеназа

Нитратредуктаза

Трансферазы

Пируваткиназа

Левансахараза

Рибонуклеаза

Гидролазы


Аминопептидаза

Субтилопептидаза

Плазмин

Ксиланаза

Фосфодиэстераза

а-Амилаза

а-Амилаза К (а-1,4-глюкан-4-глюкано-гидролаза)

Дезоксирибонуклеаза

Аргиназа

β-Ацетилглюкозаминидаза

Гидролазы

Фосфотаза фосфорилазы

Мальтаза (α-глюкозидаза)

Эстераза, сходная с карбоксилэстеразой

Ламинариназа

Лиазы

Треониндегидратаза

Пектатлиаза

Аконитатгидратаза (аконитаза)

Кетозо-1-фосфатальдолаза (альдолаза)

Среди 990 штаммов рода Bacillus, исследованных Maceda-Coronels и соавт. (1974), 860 расщепляли казеин на казеиновом агаре. У бацилл широко распро­странено свойство синтезировать фибринолитические ферменты.

У В.subtilis и В.mesenteri­cus обнаружена способность растворять экспериментально вызванные у лабораторных животных тромбы кровеносных сосудов, а также гидролизовать фибриллярный белок эластин. Протеазы этих бактерий превращают фибрин в растворимую форму путем расщепления аргинил-глициновых свя­зей фибрина.

Из клеток бацилл выделены и изучены внутриклеточные протеазы. Они появляются на ранних этапах споруляции, раньше, чем протеа­зы в культуральной жидкости. Установлена тесная взаимосвязь между внутриклеточными и внеклеточными протеазами спорулирующих бактерий. Внутриклеточные протеазы способны инициировать оборот белка и принимать участие в споруляционно-специфической пост­трансляционной модификации белков.

С помощью афинной хроматографии выделены в гомогенном виде внутриклеточные протеазы из В.subtilis и В.licheniformis, уста­новлена их гомологичность, что подтверждает родство этих двух видов.

Известны протеазы бацилл преимущественно двух типов — сериновые и металлопротеазы. Так, из В.subtilis выделены две гомогенные сериновые протеазы, отличающиеся молекулярной массой: I – 23000-24000 Д, II - 29000 Д; и смесь протеаз с молекулярной массой 26000 Д. В.subtilis может синтезировать одновременно металлопротеазы и сериновые протеазы.

Протеазы бактерий рода Bacillus делятся на щелочные и нейтраль­ные по рН-оптимуму их действия. Значительно реже у них обнаружи­ваются кислые протеазы. Наиболее известны и хорошо изучены щелоч­ные протеазы — субтилизин А (субтилопептидаза А), субтилизин В (Novo), субтилизин BPN, выделенные из различных штаммов В. subtilis.

Из В.subtilis получена щелочная протеиназа с оптиму­мом действия при рН 10,5-11,0 и температуре 55°С, устойчивая к ПАВ.

В.subtilis продуцирует и нейтральные протеазы. Оптимум их действия проявляется в диапазоне рН около 7,0. Общим признаком этих ферментов является наличие ионов металлов в активном центре и действие ингибиторов типа ЭДТА.

Бациллы образуют обычно комплекс ферментов с близкими физико-химическими и каталитическими свойствами. Препараты щелочных протеаз из В.subtilis и В.licheniformis гетерогенны и состоят из нескольких ком­понентов. По скорости движения на электрофореграммах протеолитические компоненты препаратов разделены на шесть типов, три из кото­рых отнесены к субтилизинам.

Протеолитические ферменты привлекают большое внимание не только ввиду их распространенности и большого значения для жизни клетки, но и в связи с перспективами их применения в народном хозяй­стве, медицине и ветеринарии.

Протеолитические ферменты использу­ют в парфюмерии и косметике; в микробиологической промышленности для приготовле­ния питательных сред; в биохимии для теоретических исследований и др.

Протеазы внедряются в ветери­нарную практику и медицину для лечения воспалительных процессов, для очистки гнойных и некротических ран, ожогов, обмораживаний, для растворения тромбов и лечения некоторых опухолей. Разработаны промышленные способы получения субтилизинов, протосубтилизинов, мезентеринов, амилосубтилина.

Среди других ферментов бацилл большой интерес представляют внутриклеточные литические ферменты.

В.subtilis – это первый мик­роорганизм, у которого была обнаружена способность лизировать не только собственные клетки, но и клетки других бактерий и грибов.

Литические ферменты бацилл представляют собой сложный комп­лекс, состоящий из ферментов с различной субстратной специфич­ностью. Они делятся на две группы: ферменты, участвующие в лизисе клеточных стенок бактерий, и ферменты, лизирующие клеточные стен­ки дрожжей и микроскопических грибов.

Бактериолитические ферменты некоторых аэробных спорообразующих бактерий проявляют высокую активность в отношении клеточных стенок M.lysodeikticus, В.megaterium, S.aureus, P.aeruginosa, E.coli, S.typhimurium.

Литические ферменты бацилл применяются в микробиологической промышленности для производства амилосубтилина, в животноводстве - для улучшения качества кормового белка, в медицине - в качестве анти­микробных агентов, а также - в теоретических ис­следованиях для расшифровки структуры клеточных стенок микроор­ганизмов.

Бактерии рода Bacillus вырабатывают α- и β-амилазы, глюкозидазы, глюкозоизомеразы, которые можно использовать для получения глю­козы, мальтозы, глюкозо-фруктозных паток. Из этих ферментов широкое промышленное применение нашла амилаза, кото­рая используется в пищевой промышленности.

Фермент α-амилаза гидролизует α-1,4-глюконовые связи в полисахаридах и обладает активной разжижающей способностью. Этот фермент образуется культурами В.subtilis и В.amyloliqulfaciens.

Фермент β-амилаза является осахаривающим ферментом, гидролизующим крахмал с образованием мальтозы.

Практическое применение находят пектиназа - для мочки лубоволокнистых растений; пенициллиназа (β-лактамаза) - в медицине и фармацевтической промышленности.

Иммобилизация некоторых ферментов бацилл позволила во много раз увеличить срок хранения ферментов и перейти к непрерывным техно­логическим процессам. Например, в производстве пива используют иммобилизованную протеазу В.subtilis в качестве стабилизатора против белкового помутнения.

Оказалось возможным иммобилизовать не только ферменты, но и живые клетки, которые в этом состоянии способны осу­ществлять ферментативные реакции в течение длительного времени. Так, разработан способ включения клеток В.subtilis в 5%-ный акриламидный гель с сохранением иммобилизованными клетками актив­ности α-амилазы.

Благодаря высокой биохимической активности, многообразию мета­болических путей аэробные спорообразующие бактерии участвуют в биологическом разрушении чужеродных токсических соединений и мо­гут быть использованы для борьбы с загрязнением окружающей среды.

Аэробные спорообразующие бактерии обладают способностью к повышенной экскреции свободных аминокислот в культуральную среду и могут служить источником их получения в крупномасштаб­ном производстве.

Среди выделяемых бацилл большинство штаммов (до 43%) образу­ют лизин, 21,5% штаммов — фенилаланин, 7% штаммов образуют цистин, метионин, гистидин; 3,5% штаммов — триптофан.

По данным Romero и соавт. (1978), из 38 исследованных штаммов рода Bacillus, 31 образовывал аргинин, 30 - лизин, 26 - лейцин, 26 - аспарагин.

Валин в наибольших количествах накапливается в куль­турах В.subtilis. Концентрация валина в культуральной жидкости при выращивании В.subtilis на глюкозно-солевой среде достигает 4,8 г/л.

Аминокислоты, продуцируемые бациллами, обладают золоторастворяющими свойствами, что имеет большое практическое значение для получения этого ценного металла в трудных для гидрометаллургии условиях.

Аэробные спорообразующие бактерии изучаются как возможные продуценты белка. Установлено, что белковая масса бацилл содержит все незаменимые аминокислоты, за исключением серосодержащих. Выход биомассы при выращивании в ферментере с добавками мелассы составляет 15-20 г сухого вещества на 1 л питательной среды. Биомасса при этом содержит 8-9% азота, 40% белка, до 30% поли-β-оксимасляной кислоты и 10-14% РНК.

У бацилл обнаружена способность образовывать внеклеточный бе­лок.

Бактерии рода Bacillus с 1959-60 гг. известны как продуценты пуриновых нуклеотидов, широко используемых в пищевой промышлен­ности в качестве приправ, а также в медицине для лечения некоторых вирусных инфекций, тромбозов и др.

Селекционированы штаммы В.subtilis, продуцирующие в глюкозной среде при 30-32°С в течение 60-72 ч инозита - до 11,65 г/л, гипоксантина - до 2,05 г/л, гуанозина - до 15-16 г/л. Эти штаммы используются для получения нуклеотидов путем управля­емой ферментации, в том числе многоступенчатой, а также посредством разрушения выделяемых нуклеиновых кислот.

Бациллы могут быть источником получения ингибиторов некоторых ферментов и антагонистов витаминов. Из культуральной жидкости В.amyloliquifaciens, В.polymyxa, В.subtilis, В.subtilis v.niger выделены ингибиторы глюкозидаз. Активными антагонистами витамина В12 у бацилл, в частности у В. cereus, являются пептиды.

Бациллы синтезируют витамины и выделяют их в среду. Многие штаммы, изолированные из ризосферы, продуцируют витамин В12 - до 50-60 мкг/мл. Этот витамин получают в ряде стран промышленным путем из отселекционированных штаммов бацилл.

Ростостимулирующая активность некоторых штаммов бацилл объясняется продуцированием комплекса витаминов - тиа­мина, пиридоксина, пантотеновой кислоты, инозита, никотиновой кислоты.

Получены мутанты В.subtilis, синтезирующие витамин В6 (2-5 мг/л), рибофлавин и др.



Приведенные данные свидетельствуют о высокой биологической активности В.subtilis, широком спектре синтезируемых веществ, имеющих огромное значение для современной биотехнологии и ветеринарии.




База данных защищена авторским правом ©bezogr.ru 2016
обратиться к администрации

    Главная страница